Cultivar e Manter<em> Clostridium difficile</em> Em um ambiente anaeróbico

Summary

Clostridium difficile é uma bactéria patogênica que é um anaeróbio estrito e causa diarreia associada a antibióticos (DAA). Aqui, os métodos para o isolamento, a cultura e manter C. As células vegetativas difficile e esporos são descritos. Essas técnicas necessitam de uma câmara de anaerobiose, o que requer uma manutenção regular para garantir condições adequadas para melhor C. cultivo difficile.

Abstract

Clostridium difficile é um, anaeróbico, esporogênico bactéria Gram-positiva que é a principal responsável pela diarreia associada a antibióticos (DAA) e é um agente patogénico nosocomial significativa. C. difficile é notoriamente difícil de isolar e cultivar e é extremamente sensível ao mesmo níveis baixos de oxigênio no ambiente. Aqui, os métodos para isolar C. difficile em amostras de fezes e subsequentemente cultura C. difficile para a preparação de ações de glicerol para o armazenamento de longo prazo são apresentados. As técnicas para a preparação e enumerando estoques de esporos em laboratório para uma variedade de aplicações a jusante, incluindo estudos de microscopia e animais, também são descritos. Essas técnicas necessitam de uma câmara de anaerobiose, que mantém um ambiente anaeróbico consistente para assegurar condições adequadas para melhor C. crescimento difficile. Nós fornecemos protocolos para a transferência de materiais dentro e fora da câmara sem causando contaminação significativa de oxigênio, juntamente com sugestões para a manutenção regular necessária para sustentar o ambiente anaeróbico adequado para eficiente e consistente C. cultivo difficile.

Introduction

Clostridium difficile é uma bactéria formadora de esporos, Gram-positiva que é um anaeróbio obrigatório e um agente patogénico gastrointestinal potencialmente fatal dos seres humanos e animais. Inicialmente descrita em 1935 como um organismo comensal encontrada em amostras de fezes de recém-nascidos ^1, C. difficile foi mais tarde demonstrado ser o agente causador de colite pseudomembranosa associada ao tratamento com antibióticos ^2. C. infecções difficile (CDI) são tipicamente precedido por tratamento com antibióticos, que resulta na interrupção da flora do cólon normais, criando um nicho para C. difficile prosperar ^2. C. difficile é transmitida como um esporo dormente através da via fecal-oral e, posteriormente, germina no interior do trato gastrintestinal, produzindo células vegetativas capazes de gerar diversas toxinas e causar doença grave e colite ^3. CDI são muitas vezes refractária aos tratamentos convencionais e estes emperfeições são freqüentemente recorrentes ^4. Como resultado, o CDI é responsável por até US $ 4,8 bilhões em custos de saúde nos Estados Unidos ^5-7.

O C. difficile é muito sensível mesmo a baixos níveis de oxigénio no ambiente. Para C. difficile a persistir no meio ambiente e ser eficientemente transmitida de um hospedeiro para outro, a formação de um esporo metabolicamente inativas é fundamental ^8. Porque a manutenção de laboratório e manipulação de C. difficile requer um ambiente anaeróbio controlada, estas técnicas requerem a utilização de uma câmara anaeróbica. O uso de câmaras anaeróbias resultou num aumento da recuperação e isolamento de anaeróbios obrigatórios ^9-11, e permitiu que um número de técnicas de biologia molecular para ser realizado em uma atmosfera anaeróbia.

Além C. difficile, o uso da câmara anaeróbia e manutenção descritas aqui são aplicáveispara outros anaeróbios obrigatórios, como outras espécies Clostridium (por exemplo, C. perfringens), outras espécies gastrointestinais (por exemplo, espécies de Bacteroides ¹²⁾ e patógenos periodontais (por exemplo, espécies Peptostreptococcos ^13).

Protocol

Nota: C. difficile é um agente patogénico humano ou animal, que pode causar a doença gastrointestinal. Experimentos envolvendo C. difficile deve ser realizada com medidas de biossegurança adequadas (BSL-2). 1. Anaerobic Câmara Uso e Manutenção O C. difficile é um anaeróbio estrito e é extremamente sensível mesmo a baixas concentrações de oxigénio na atmosfera. Portanto, um ambiente anaeróbio controlada é necessária para a…

Representative Results

Um exemplo de C. difficile cultivadas em BHIS e Columbia anaeróbio ovelhas meios de agar de sangue pode ser visto na Figura 2. C. difficile forma colônias irregulares que são planas e possuem uma aparência de vidro fosco que é evidente em ambos os meios. Aqui, um isolado clínico sensível à eritromicina de C. difficile, 630E 30, é cultivada em BHIS agar, num meio não-selectivo enriquecido, durante 24 horas a 37 ° C (Figura 2A). As colónia…

Discussion

Os métodos descritos aqui permitir a recuperação simples e rápida de C. difficile a partir de uma variedade de amostras fecais, incluindo seres humanos, ratos e hamsters, bem como o armazenamento a longo prazo de C. difficile como ações de glicerol ou de esporos. C. difficile pode ser um organismo difíceis de cultivar, mas a manutenção cuidadosa de um ambiente anaeróbico e a aplicação de técnicas de assepsia pode proporcionar para um crescimento robusto e uma redução na contamin…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Proteose Peptone no. 2	BD	212120
Na2HPO4	Fisher	S373
KH2PO4	Fisher	BP362
NaCl	Fisher	S27
MgSO4 (anhydrous)	Fisher	M65
ᴅ-Fructose	Fisher	L96
Sodium taurocholate	Sigma	T4009
ᴅ-cycloserine	Sigma	C6880
Cefoxitin	Fluka	C4786
Brain heart infusion medium	BD	237300
Proteose Peptone	BD	211684
(NH4)2SO4	Sigma	A5132
Tris base	Fisher	BP152
Agar	BD	214010
L-cysteine	Sigma	C7755
BactoPeptone	BD	211684
Columbian sheep blood agar	Fisher	L21928
NaCl	Fisher	S27
KCl	Fisher	P217
Glycerol	Fisher	BP2291
Sterile inoculating loops	Fisher	22363596
Sterile swabs	Fisher	1495990
Coy Vinyl Anaerobic Chamber and Accessories	Coy Laboratory Products, Inc	Customer Specified	These items are custom ordered per laboratory needs
			Materials
			TCCFA agar Proteose peptone no. 2 (Difco) 40 g Na2HPO4 5 g KH2PO4 1 g NaCl 2 g MgSO4 (anhydrous) 0.1 g Fructose 6 g Agar 20 g Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add: 10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 0.1%) 25 ml of 10 mg/ml ᴅ-cycloserine, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 250 μg/ml) 1.6 ml of 10 mg/ml cefoxitin, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 16 μg/ml) BHIS Medium Brain heart infusion 37 g Yeast extract 5 g For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. Optional (add after autoclaving): 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate (dissolve in water; final concentration, 0.1%) SMC Sporulation Medium BactoPeptone 90 g Protease peptone 5 g (NH4)2SO4 1 g Tris base 1.5 g Agar 15 g Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. Optional (add after autoclaving): 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 70:30 Medium BactoPeptone 63 g Protease peptone 3.5 g Brain heart infusion 11.1 g Yeast extract 1.5 g (NH4)2SO4 0.7 g Tris base 1.06 g For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (final concentration, 0.03%). Blood agar The use of premade Columbia anaerobic sheep blood agar plates (Fisher Scientific, L21928)35 is recommended. 1X Phosphate buffered saline (PBS) NaCl 8.01 g KCl 0.2 g Na2HPO4 1.44 g KH2PO4 0.27 g Bring to 1 L with deionized water and adjust pH to 7.4 with HCl. Filter sterilize before use.