सेल संचार विश्लेषण के लिए एकल कोशिका Microinjection
Summary
हम यहाँ वर्णन कैसे जीवित कोशिकाओं में अंतर-जंक्शनों के माध्यम से सेलुलर संचार कल्पना करने के लिए लूसिफ़ेर पीले रंग का एक एकल कोशिका microinjection करते हैं, और कुछ उपयोगी सुझाव प्रदान करने के लिए। हम जानते हैं कि इस पत्र कार्यात्मक अंतराल जंक्शनों के कारण सेलुलर युग्मन की डिग्री का मूल्यांकन करने के लिए हर किसी को मदद मिलेगी उम्मीद है। यहाँ वर्णित सब कुछ सिद्धांत रूप में हो सकता है,, 1000 Daltons नीचे आणविक वजन के साथ अन्य फ्लोरोसेंट रंजक के लिए अनुकूलित।
Abstract
Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.
Introduction
अंतराल जंक्शनों कहनेवाला चैनलों कि पड़ोसी की कोशिकाओं के बीच 1 ख़बर अनुमति देते हैं। यह संचार दो या अधिक पड़ोसी कोशिकाओं, जहां हर एक को एक connexon या hemichannel साथ योगदान देता है कहनेवाला चैनल फार्म को जोड़ता है। स्तनधारी कोशिकाओं में, connexon छह connexins, चार transmembrane डोमेन और एक सी है और कोशिका द्रव्य 2 के भीतर एन टर्मिनल के साथ monomers द्वारा बनाई है। अंतराल जंक्शनों न केवल, आयनों, दूसरा दूत और छोटे चयापचयों के प्रवाह की अनुमति है, लेकिन यह भी इस तरह के synaptic प्रसारण, दिल संकुचन, सेल के विकास और भेदभाव 3, 4, 5, 6 के रूप में कई शारीरिक प्रक्रियाओं में सेलुलर संचार के कई रूपों के लिए योगदान 7, 8। इसके अलावा अंतराल जंक्शनों के साथ संबद्ध किया गया हैकैंसर 9, 10, 11 पेशी शोष, कुछ आनुवंशिक बीमारियों और रोगों 12 demyelinating सहित कई बीमारियों।
कहनेवाला crosstalk के इस प्रकार के कई तरीकों 13, 14, 15, 16 से मूल्यांकन किया जा सकता है। इस पत्र में, हम कैसे जीवित कोशिकाओं में अंतर-जंक्शनों के माध्यम से सेलुलर संचार कल्पना करने के लिए लूसिफ़ेर पीले रंग का एक एकल कोशिका microinjection प्रदर्शन करने के लिए दिखा। हम कैसे कोशिकाओं और micropipette, micromanipulator के उपयोग और एक थाइमिक उपकला कोशिका लाइन में लूसिफ़ेर पीले रंग का इंजेक्शन तैयार करने पर चर्चा की। आमतौर पर, इस प्रयोगात्मक प्रक्रिया सेल डाई के साथ लोड करने के लिए लॉग इन कोशिकाओं की औसत से विश्लेषण किया जा सकता है। इसके अलावा, इस विधि की खाई नीचे आणविक वजन के साथ अन्य फ्लोरोसेंट रंगों के साथ प्रयोग किया जा सकता हैजंक्शनों कट ऑफ जो लगभग 1,000 डाल्टन है।
Protocol
Representative Results
Discussion
आदेश में हालांकि कहनेवाला चैनलों द्वारा पारगम्य 16 के लिए आवश्यक हैं, कार्यात्मक कहनेवाला खाई जंक्शन की उपस्थिति, ट्रेसर, जो झिल्ली अभेद्य हैं का उपयोग सत्यापित करने के लिए। Fluorescein, पहले फ्लोरोस…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors dedicate this paper in honor of Prof. Gilberto Oliveira-Castro who introduced research in intercellular communication by gap junctions in Brazil. This work was funded by Capes, CNPQ and Faperj.
Materials
| Lucifer yellow | Sigma | L0259 | |
| Lithium Chloride | Sigma | L4408 | |
| PBS tablets | Sigma | P4417 | |
| RPMI | Sigma | R4130 | |
| Bovine fetal serum | Cultilab | ||
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Microscope | Nikon | TE-2000 | For microinjection experiments, one needs an inverted fluorescence microscope and filters for fluorescent microscopy |
| vibration-insulated table | Newport | VH3036W-OPT | A vibration-insulated table is needed to protect the experiments from vibration and avoid cell damage |
| Micromanipulator | Narishige | MMO-203 | This equipment allows precision adjustments of the micropipette, which is needed for cell micro injection. |
| Current Generator | Digitimer | DS2 | To produce the dye flow through the micropipette, a current below one nano ampere was given using a current generator with an electrode inside the micropipette or an amplifier which has a capacitance compensation circuit (old electrometer) or current injection functions of new patch clamp amplifiers, and the ground wire submersed in the plate dish. Alternatively, the dye can be injected by a pneumatic microinjector, following the factory recommendations. |
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