Monitoring intraspecies competitie in een bacteriële celpopulatie door cocultivatie van fluorescerend gelabelde stammen

Summary

Bacteriën kunnen tijdens hun leven schadelijke of gunstige mutaties ophopen. In een populatie van cellen kunnen individuen die gunstige mutaties hebben geaccumuleerd, snel hun medemens overtreffen. Hier presenteren we een eenvoudige procedure om intraspecies-concurrentie in een bacteriële celpopulatie in de loop van de tijd te visualiseren met behulp van fluorescerend gelabelde individuen.

Abstract

Veel micro-organismen zoals bacteriën verspreiden zich extreem snel en de populaties kunnen hoge celdichtheden bereiken. Kleine fracties van cellen in een populatie hebben altijd geaccumuleerde mutaties die schadelijk of gunstig zijn voor de cel. Als het fitnesseffect van een mutatie de subpopulatie een sterk selectief groeivoordeel biedt, kunnen de individuen van deze subpopulatie snel overcompeteren en zelfs hun directe medemensen volledig elimineren. Kleine genetische veranderingen en selectiegestuurde accumulatie van cellen die gunstige mutaties hebben verworven, kunnen dus leiden tot een volledige verschuiving van het genotype van een celpopulatie. Hier presenteren we een procedure om de snelle klaonale expansie en eliminatie van respectievelijk gunstige en schadelijke mutaties in een bacteriecelpopulatie in de loop van de tijd te monitoren door cocultivatie van fluorescerend gelabelde individuen van de Gram-positieve modelbacterie Bacillus subtilis. De methode is gemakkelijk uit te voeren en zeer illustratief om intraspecies concurrentie weer te geven tussen de individuen in een bacteriële celpopulatie.

Introduction

Bodembacteriën zijn meestal begiftigd met flexibele regulerende netwerken en brede metabolische capaciteiten. Beide functies stellen de cellen in staat om hun katabole en anabole paden aan te passen om te concurreren met hun collega’s en andere micro-organismen voor de voedingsstoffen, die beschikbaar zijn in een bepaalde ecologische niche¹. Als de bacteriën zich echter niet kunnen aanpassen aan hun omgeving, kunnen andere mechanismen het voortbestaan van een soort verklaren. Inderdaad, omdat veel bacteriën zich snel verspreiden en de populaties hoge celdichtheden kunnen bereiken, kunnen subpopulaties spontaan gunstige mutaties hebben geaccumuleerd die de cellen een selectief groeivoordeel bieden en daarom hun conditie verhogen. Bovendien kunnen mutatiehotspots en stress-geïnduceerde adaptieve mutagenese de evolutie van een maladapted bacterie^2,3vergemakkelijken. Accumulatie van mutaties en groei onder continue selectie is dus de oorsprong voor de enorme microbiële diversiteit, zelfs binnen hetzelfde geslacht^4,5. Net als in de natuur komt het vormen van bacteriële genomen ook voor in het laboratorium als gevolg van continue teelt onder selectie. Dit wordt geïllustreerd door de domesticatie van de Gram-positieve bacterie B. subtilis, die wereldwijd wordt gebruikt in fundamenteel onderzoek en in de industrie. In de jaren 1940 werd B. subtilis behandeld met DNA-schadelijke röntgenfoto’s gevolgd door teelt onder een specifieke groeitoestand⁶. De mutaties die zich tijdens hun domesticatie in de bacteriën hebben opgehoopt, zijn verantwoordelijk voor het verlies van veel groeikenmerken, d.w.z. de B. subtilis laboratoriumstam 168 verloor het vermogen om complexe kolonies te vormen^7,8.

Tegenwoordig is voor de best bestudeerde modelbacteriën Escherichia coli en B. subtiliseen verscheidenheid aan krachtige hulpmiddelen beschikbaar om hun genomen genetisch te manipuleren om specifieke wetenschappelijke vragen te beantwoorden. Soms veroorzaakt de inactivatie van een interessant gen een ernstig groeidefect, dat dan duidelijk zichtbaar is op standaard groeimedium⁹. Mutaties die daarentegen een zwak groeidefect veroorzaken en dus slechts een geringe invloed hebben op de conditie van de stam, worden vaak genegeerd. In beide gevallen resulteren langdurige incubatie en passaging van de mutante stammen gedurende meerdere generaties echter meestal in de accumulatie van suppressor mutanten die het fenotype van de ouderstam hebben hersteld^2,9. De karakterisering van suppressor mutanten en de identificatie van de mutaties die het groeidefect van de parent mutant stam hebben hersteld is een zeer nuttige benadering die opheldering van belangrijke en vaak nieuwe cellulaire processen mogelijk maakt^10,11.

Wij zijn geïnteresseerd in de bestrijding van glutamaat homeostase in B. subtilis¹². Net als E. colireageert B. subtilis op verstoring van glutamaathomeostase (d.w.z.blok in glutamaatdegradatie²) door de accumulatie van suppressormutanten. De genomische veranderingen in deze suppressor mutanten die werden verkregen door spontane mutatie bleken glutamaat homeostase snel te herstellen^9,13. Daarom is het niet verwonderlijk dat aanpassing van B. subtilis aan een specifieke groeitoestand tijdens domesticatie van de bacterie wordt weerspiegeld in enzymsynthese en in de geëvolueerde enzymatische activiteiten, die betrokken zijn bij glutamaatmetabolisme¹². Er is gesuggereerd dat het gebrek aan exogene glutamaat in het groeimedium tijdens het domesticatieproces de drijvende kracht was voor het ontstaan en fixeren van het cryptische glutamaatdehydrogenase (GDH) gudB^CR-gen in de laboratoriumstam 168^2,14. Deze hypothese wordt ondersteund door onze observatie dat de verminderde hoeveelheid GDH-activiteit in de laboratoriumstam de bacteriën een selectief groeivoordeel biedt wanneer exogene glutamaat schaars is². Bovendien resulteert de teelt van een B. subtilis stam, het synthetiseren van de GDH GudB, bij afwezigheid van exogene glutamaat in de accumulatie van suppressor mutanten die het gudB gen²hebben geactiveerd . Het is duidelijk dat de aanwezigheid van een katabolisch actieve GDH nadelig is voor de cel omdat endogene glutamaat dat anders voor anabolisme zou kunnen worden gebruikt, wordt afgebroken tot ammonium en 2-oxoglutaraat (figuur 1). Wanneer glutamaat daarentegen door het medium wordt geleverd, heeft een B. subtilis-stam die is uitgerust met GDH-activiteit op hoog niveau een selectief groeivoordeel ten opzichte van een soort die slechts één functionele GDH synthetiseert. Het is redelijk om aan te nemen dat GDH-activiteit op hoog niveau de bacteriën in staat stelt glutamaat als tweede koolstofbron te gebruiken naast andere koolstofbronnen die door het medium² worden geleverd (zie figuur 1). GDH-activiteit heeft dus een sterke invloed op de geschiktheid van bacteriën, afhankelijk van de beschikbaarheid van exogene glutamaat.

Hier presenteren we een zeer illustratieve methode om de intraspecies-competitie tussen twee B. subtilisstammen die verschillen in een enkele locus op het chromosoom te monitoren en te visualiseren (Figuur 2). De twee stammen werden gelabeld met de yfp- en cfp-genen die coderen voor de fluoroforen YFP en GVB, en gecocultiveerd onder verschillende voedingsomstandigheden. Door na verloop van tijd te bemonsteren en door geschikte verdunningen op agarplaten te plateren, konden de overlevenden in elk van de culturen gemakkelijk worden gecontroleerd met behulp van een gemeenschappelijke stereofluorescentiemicroscoop. De procedure die in dit artikel wordt beschreven, is eenvoudig uit te voeren en geschikt om de snelle klaonale expansie en eliminatie van respectievelijk gunstige en schadelijke mutaties in een celpopulatie in de loop van de tijd te visualiseren.

Protocol

1. Voorbereiding van Agar-platen, cultuurmedia, cryostocks en preculturen Bereid groeimedia en benodigde reagentia voor (zie tabel met materialen en reagentia). Streep de B. subtilis stammen (b.v. BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp) en BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp) die respectievelijk één en twee actieve GDH’s uitdrukken)2 die zullen worden ge…

Representative Results

De hier beschreven methode werd met succes toegepast om de intraspecies-concurrentie te visualiseren in een celpopulatie bestaande uit B. subtilis-stammen die werden gelabeld met de cfp- en yfp-genen die coderen voor respectievelijk de fluoroforen GVB en YFP. Zoals weergegeven in figuur 3, kan de methode worden gebruikt om intraspecies-concurrentie op een zeer illustratieve manier te visualiseren. Door de monsters op kleine gebieden te spotten, werd de klonale samenstelling van…

Discussion

Verschillende methoden zijn ontwikkeld om de competitieve fitheid van bacteriën te analyseren¹⁶. In veel gevallen werden de bacteriën gelabeld met verschillende antibioticaresistentiecassettes¹⁷. Net als bij onze aanpak maakt het labelen van de cellen met antibioticaresistentiecassettes het mogelijk om de competitieve geschiktheid van de bacteriën tijdens cocultivatie onder gedefinieerde groeiomstandigheden te evalueren. Bovendien kan deze methode worden gebruikt om de competitieve geschiktheid t…

Materials

(NH4)2SO4	Roth, Germany	3746	–
Agar	Difco, USA	214010	–
Ammonium ferric citrate (CAF)	Sigma-Aldrich, Germany	9714	–
CaCl2	Roth, Germany	5239	–
Glucose	Applichem, Germany	A3617	–
Glycerol	Roth, Germany	4043	–
K2HPO4 x 3 H2O	Roth, Germany	6878	–
KCl	Applichem, Germany	A3582	–
KH2PO4	Roth, Germany	3904	–
KOH	Roth, Germany	6751	–
MgSO4 x 7 H2O	Roth, Germany	P027	–
MnCl2	Roth, Germany	T881	–
MnSO4 x 4 H2O	Merck Millipore, Germany	102786	–
NaCl	Roth, Germany	9265	–
Nutrient broth	Roth, Germany	X929	–
Potassium glutamate	Applichem, Germany	A3712	–
Tryptone	Roth, Germany	8952	–
Tryptophan	Applichem, Germany	A3445	–
Yeast extract	Roth, Germany	2363	–
1.5 ml Reaction tubes	Sarstedt, Germany	72,690,001	–
2.0 ml Reaction tubes	Sarstedt, Germany	72,691	–
15 ml Plastic tubes with screw cap	Sarstedt, Germany	62,554,001	–
Petri dishes	Sarstedt, Germany	82.1473	–
1.5 ml Polystyrene cuvettes	Sarstedt, Germany	67,742	–
15 ml Glass culture tubes	Brand, Germany	7790 22	–
with aluminium caps
100 ml Shake flasks with aluminium caps	Brand, Germany	928 24	–
Sterile 10 ml glass pipettes	Brand, Germany	278 23	–
Incubator (28 and 37 °C)	New Brunswick	M1282-0012	–
Standard pipette set (2-20 μl, 10-100 μl, 100-1000 μl)	Eppendorf, Germany	4910 000.034, 4910 000.042,	–
		4910 000.042,
		4910 000.069
Table top centrifuge for 1.5 and 2 ml reaction tubes	Thermo Scientific, Heraeus Fresco 21, Germany	75002425	–
Table top centrifuge for 15 ml plastic tubes	Heraeus Biofuge Primo R, Germany	75005440	–
Standard spectrophotometer	Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, Germany	80-2112-21	–
Stereofluorescence microscope	Zeiss SteREO Lumar V12, Germany	495008-0009-000	–
Freezer (-20 and -80 °C)	–	–	–
Fridge (4 °C)	–	–	–
Autoclave	Zirbus, LTA 2x3x4, Germany	–	–
pH meter	pH-meter 766, Calimatic, Knick, Germany	766	–
Vortex	Vortex  3, IKA, Germany	3340000	–
Balance	CP2202S, Sartorius, Germany	replaced by	–
		CPA2202S
Black pen (permanent marker)	Staedler, Germany	317-9	–
Powerpoint program	Microsoft, USA	–	–
Office Excel program	Microsoft, USA	–	Program for data processing
Adobe Photoshop CS5	Adobe, USA	replaced by CS6, download	Computer program for image processing
Computer	PC or Mac	–	–
ZEN pro 2011 software for the stereofluorescence microscope	Zeiss, Germany	410135 1002 110	AxioCam MRc Rev. Obtained through Zeiss
Specific solution recipes
SP medium
8 g Nutrient broth
0.25 mg MgSO4 x 7 H2O
1 g KCl
if required, add 15 g agar for solid SP medium
ad 1 l with H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
1 ml CaCl2 (0.5 M), sterilized by filtration
1 ml MnCl2 (10 mM) sterilized by filtration
2 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
LB medium
10 g Tryptone
5 g Yeast extract
10 g NaCl
if required, add 15 g agar for solid LB medium
ad 1 l with H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
C-Glc minimal medium
200 ml 5 x C salts
10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml III’ salts
25 ml Glucose (20%), autoclaved for 20 min at 121 °C
ad 1 l with sterile H2O
CE-Glc minimal medium
200 ml 5 x C salts
10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml III’ salts
20 ml Glutamate (40%)
25 ml Glucose (20%), autoclaved for 20 min at 121 °C
ad 1 l with sterile H2O
5 x C salts
20 g KH2PO4
80 g K2HPO4 x 3 H2O
16.5 g (NH4)2SO4
ad 1 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
III’ salts
0.232 g MnSO4 x 4 H2O
12.3 g MgSO4 x 7 H2O
ad 1 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
40% Glutamate solution
200 g L-Glutamic acid
adjust the pH to 7.0 by adding approximately 80 g KOH
ad 0.5 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
0.9% Saline (NaCl) solution
ad 1 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
50% Glycerol solution
295 ml Glycerol (87%)
ad 0.5 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
Bacteria (All strains are based on the Bacillus subtilis strain 168)
Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp)			Laboratory strain collection
Bacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-cfp)
Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp)
Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-yfp)