Floresan Etiketli Suşların Cocultivation'ı ile Bakteri Hücre Popülasyonunda İntraspecies Rekabetini İzleme

Summary

Bakteriler yaşamları boyunca zararlı veya faydalı mutasyonlar biriktirebilir. Bir hücre popülasyonunda, yararlı mutasyonlar biriktirmiş bireyler, arkadaşlarını hızla geride kalabilir. Burada, floresan etiketli bireyleri kullanarak zaman içinde bakteri hücresi popülasyonunda tür içi rekabeti görselleştirmek için basit bir prosedür sunuyoruz.

Abstract

Bakteri gibi birçok mikroorganizma son derece hızlı çoğalır ve popülasyonlar yüksek hücre yoğunluklarına ulaşabilir. Bir popülasyondaki hücrelerin küçük fraksiyonları her zaman hücre için zararlı veya faydalı olan birikmiş mutasyonlara sahiptir. Bir mutasyonun fitness etkisi, alt nüfusa güçlü bir seçici büyüme avantajı sağlarsa, bu alt nüfusa sahip bireyler hızla rakip olabilir ve hatta yakın arkadaşlarını tamamen ortadan kaldırabilir. Bu nedenle, yararlı mutasyonlar elde eden hücrelerin küçük genetik değişiklikleri ve seçim odaklı birikimi, bir hücre popülasyonunun genotipinin tamamen kaymasına neden olabilir. Burada, gram-pozitif model bakteri bacillus subtilisfloresan etiketli bireylerinin birlikte çalıştırıldığı zaman içinde bakteri hücre popülasyonunda, sırasıyla yararlı ve zararlı mutasyonların hızlı klonal genişlemesini ve ortadan kaldırılmasını izlemek için bir prosedür sunuyoruz. Yöntemin gerçekleştirilmesi kolaydır ve bakteri hücre popülasyonundaki bireyler arasında tür içi rekabeti göstermek çok açıklayıcıdır.

Introduction

Toprak bakterileri genellikle esnek düzenleyici ağlar ve geniş metabolik kapasitelerle donatılmıştır. Her iki özellik de hücrelerin katabolik ve anabolik yollarını, belirli bir ekolojik nişte bulunan besinler için arkadaşları ve diğer mikroorganizmalarla rekabet edecek şekilde ayarlamalarını sağlar¹. Bununla birlikte, bakteriler çevrelerine uyum sağlayamazsa, diğer mekanizmalar bir türün hayatta kalmasını açıklayabilir. Gerçekten de, birçok bakteri hızlı çoğaldığı ve popülasyonlar yüksek hücre yoğunluklarına ulaşabildiğinden, alt popülasyonlar hücrelere seçici bir büyüme avantajı sağlayan ve bu nedenle zindeliklerini artıran kendiliğinden birikmiş faydalı mutasyonlara sahip olabilir. Ayrıca, mutasyonel sıcak noktalar ve strese bağlı adaptif mutajensis, maladapted bir bakterinin evrimini kolaylaştırabilir^2,3. Bu nedenle, sürekli seçim altında mutasyonların ve büyümenin birikmesi, aynı cins içinde bile muazzam mikrobiyal çeşitliliğin kökenidir^4,5. Doğada olduğu gibi, bakteri genomlarının şekillendirilmesi de seçim altında sürekli ekim nedeniyle laboratuvarda meydana gelir. Bu, temel araştırmalarda ve endüstride dünya çapında kullanılan Gram-pozitif bakteri B. subtilis’in evcilleştirilmesi ile örneklenmiştir. 1940’larda B. subtilis DNA’ya zarar veren X ışınları ile tedavi edildi ve ardından belirli bir büyüme koşulu altında ekim^{yapıldı 6}. Evcilleştikleri sırada bakterilerde biriken mutasyonlar, birçok büyüme özelliğinin kaybını, yani B. subtilis laboratuvar suşu 168 karmaşık koloniler oluşturma yeteneğini kaybetti^7,8.

Günümüzde, en iyi çalışılan model bakteriler Escherichia coli ve B. subtilisiçin, belirli bilimsel soruları ele almak için genomlarını genetik olarak manipüle etmek için çeşitli güçlü araçlar mevcuttur. Bazen bir ilgi geninin inaktivasyonu, daha sonra standart büyüme ortamında açıkça görülebilen ciddi bir büyüme kusuruna neden olur⁹. Bunun aksine, zayıf bir büyüme kusuru neden olan ve böylece suşun kondisyonunu sadece biraz etkileyen mutasyonlar genellikle göz ardı edilir. Bununla birlikte, her iki durumda da mutant suşlarının birkaç nesil boyunca uzun süreli inkübasyonu ve geçişi genellikle ana suşun fenotipini geri kazandıran baskılayıcı mutantların birikmesine neden^2,9. Baskılayıcı mutantların karakterizasyonu ve ebeveyn mutant suşunun büyüme kusurunu geri kazandıran mutasyonların tanımlanması, önemli ve genellikle yeni hücresel süreçlerin aydınlatılmasına izin veren çok yararlı bir yaklaşımdır^10,11.

Biz B. subtilis¹²glutamat homeostaz kontrolü ile ilgileniyoruz. E. coli’yebenzer şekilde, B. subtilis glutamat homeostazının(yaniglutamat bozulmasında blok²⁾bastırıcı mutantların birikmesiyle pertürbasyonuna yanıt verir. Spontan mutasyonla elde edilen bu baskılayıcı mutantlardaki genomik değişikliklerin glutamat homeostazını hızla geri getirdiği gösterilmiştir^9,13. Bu nedenle, B. subtilis’in bakterinin evcilleştirmesi sırasında belirli bir büyüme durumuna adaptasyonunun enzim sentezinde ve glutamat metabolizmasında yer alan evrimleşmiş enzimatik aktivitelerde yansıtılması şaşırtıcı değildir¹². Evcilleştirme işlemi sırasında büyüme ortamında eksojen glutamat eksikliğinin, laboratuvar suşu 168^2,14’tekriyotik glutamat dehidrogenaz (GDH) gudB^CR geninin ortaya çıkması ve sabitlenmesi için itici güç olduğu ileri sürülmüştür. Bu hipotez, laboratuvar suşundaki GDH aktivitesinin azalmasının, eksojen glutamat az olduğunda bakterilere seçici bir büyüme avantajı sağladığı gözlemimiz ile desteklenmektedir². Ayrıca, bir B. subtilis suşunun yetiştirilmesi, GDH GudB sentezlenmesi, eksojen glutamat yokluğunda gudB genini inaktive eden baskılayıcı mutantların birikmesi ile sonuçlanır². Açıkçası, katabolik olarak aktif bir GDH’nin varlığı hücre için dezavantajlıdır, çünkü anabolizma için kullanılabilecek endojen olarak üretilen glutamat amonyum ve 2-oksioglutarat olarak bozulur (Şekil 1). Bunun aksine, glutamat ortam tarafından sağlandığında, üst düzey GDH aktivitesi ile donatılmış bir B. subtilis suşu, sadece bir fonksiyonel GDH sentezleyen bir suş üzerinde seçici bir büyüme avantajına sahiptir. Üst düzey GDH aktivitesinin, bakterilerin orta² tarafından sağlanan diğer karbon kaynaklarına ek olarak ikinci bir karbon kaynağı olarak glutamat kullanmasına izin verdiğini varsaymak mantıklıdır (bkz. Şekil 1). Bu nedenle, GDH aktivitesi, eksojen glutamanın mevcudiyetine bağlı olarak bakterilerin zindeliğini güçlü bir şekilde etkiler.

Burada, kromozom üzerinde tek bir lokusta farklılık gösteren iki B. subtilis suşu arasındaki tür içi rekabeti izlemek ve görselleştirmek için çok açıklayıcı bir yöntem sunuyoruz (Şekil 2). İki suş, floroforlar YFP ve CFP’yi kodlayan yfp ve cfp genleri ile etiketlendi ve farklı beslenme koşulları altında birlikte çalıştı. Zamanla örnekleme yaparak ve agar plakalarına uygun seyreltmeler yaparak, kültürlerin her birinde hayatta kalanlar ortak bir stereo floresan mikroskobu kullanılarak kolayca izlenebilir. Bu makalede açıklanan prosedürün gerçekleştirilmesi kolaydır ve zaman içinde bir hücre popülasyonunda sırasıyla yararlı ve zararlı mutasyonların hızlı klonal genişlemesini ve ortadan kaldırılmasını görselleştirmek için uygundur.

Protocol

1. Agar Tabaklarının, Kültür Medyasının, Kriyostockların ve Ön Kültürlerin Hazırlanması Büyüme ortamı ve gerekli reaktifleri hazırlayın (bkz. malzeme ve reaktifler tablosu). B. subtilis suşlarını çizgile (örneğin. BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp) ve BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp) sırasıyla bir ve iki aktif GDH ifade eden)2</…

Representative Results

Burada açıklanan yöntem, sırasıyla florofor cfp ve YFP’yi kodlayan cfp ve yfp genleri ile etiketlenmiş B. subtilis suşlarından oluşan bir hücre popülasyonunda tür içi rekabeti görselleştirmek için başarıyla uygulanmıştır. Şekil 3’tegösterildiği gibi, yöntem tür içi rekabeti çok açıklayıcı bir şekilde görselleştirmek için kullanılabilir. Örneklerin küçük alanlarda tespit haline getirerek, hücre popülasyonunun klonal bileşimi bir bakı?…

Discussion

Bakterilerin rekabetçi uygunluğunu analiz etmek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir¹⁶. Çoğu durumda bakteriler farklı antibiyotik direnç kasetleri ile etiketlenmiştir¹⁷. Yaklaşımımıza benzer şekilde, hücrelerin antibiyotik direnç kasetleri ile etiketlanması, tanımlanmış büyüme koşulları altında kokültivasyon sırasında bakterilerin rekabetçi zindeliğinin değerlendirilmesini sağlar. Ayrıca, bu yöntem kromozom^17’dekibelirli bir çekirgede birbirinden…

Materials

(NH4)2SO4	Roth, Germany	3746	–
Agar	Difco, USA	214010	–
Ammonium ferric citrate (CAF)	Sigma-Aldrich, Germany	9714	–
CaCl2	Roth, Germany	5239	–
Glucose	Applichem, Germany	A3617	–
Glycerol	Roth, Germany	4043	–
K2HPO4 x 3 H2O	Roth, Germany	6878	–
KCl	Applichem, Germany	A3582	–
KH2PO4	Roth, Germany	3904	–
KOH	Roth, Germany	6751	–
MgSO4 x 7 H2O	Roth, Germany	P027	–
MnCl2	Roth, Germany	T881	–
MnSO4 x 4 H2O	Merck Millipore, Germany	102786	–
NaCl	Roth, Germany	9265	–
Nutrient broth	Roth, Germany	X929	–
Potassium glutamate	Applichem, Germany	A3712	–
Tryptone	Roth, Germany	8952	–
Tryptophan	Applichem, Germany	A3445	–
Yeast extract	Roth, Germany	2363	–
1.5 ml Reaction tubes	Sarstedt, Germany	72,690,001	–
2.0 ml Reaction tubes	Sarstedt, Germany	72,691	–
15 ml Plastic tubes with screw cap	Sarstedt, Germany	62,554,001	–
Petri dishes	Sarstedt, Germany	82.1473	–
1.5 ml Polystyrene cuvettes	Sarstedt, Germany	67,742	–
15 ml Glass culture tubes	Brand, Germany	7790 22	–
with aluminium caps
100 ml Shake flasks with aluminium caps	Brand, Germany	928 24	–
Sterile 10 ml glass pipettes	Brand, Germany	278 23	–
Incubator (28 and 37 °C)	New Brunswick	M1282-0012	–
Standard pipette set (2-20 μl, 10-100 μl, 100-1000 μl)	Eppendorf, Germany	4910 000.034, 4910 000.042,	–
		4910 000.042,
		4910 000.069
Table top centrifuge for 1.5 and 2 ml reaction tubes	Thermo Scientific, Heraeus Fresco 21, Germany	75002425	–
Table top centrifuge for 15 ml plastic tubes	Heraeus Biofuge Primo R, Germany	75005440	–
Standard spectrophotometer	Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, Germany	80-2112-21	–
Stereofluorescence microscope	Zeiss SteREO Lumar V12, Germany	495008-0009-000	–
Freezer (-20 and -80 °C)	–	–	–
Fridge (4 °C)	–	–	–
Autoclave	Zirbus, LTA 2x3x4, Germany	–	–
pH meter	pH-meter 766, Calimatic, Knick, Germany	766	–
Vortex	Vortex  3, IKA, Germany	3340000	–
Balance	CP2202S, Sartorius, Germany	replaced by	–
		CPA2202S
Black pen (permanent marker)	Staedler, Germany	317-9	–
Powerpoint program	Microsoft, USA	–	–
Office Excel program	Microsoft, USA	–	Program for data processing
Adobe Photoshop CS5	Adobe, USA	replaced by CS6, download	Computer program for image processing
Computer	PC or Mac	–	–
ZEN pro 2011 software for the stereofluorescence microscope	Zeiss, Germany	410135 1002 110	AxioCam MRc Rev. Obtained through Zeiss
Specific solution recipes
SP medium
8 g Nutrient broth
0.25 mg MgSO4 x 7 H2O
1 g KCl
if required, add 15 g agar for solid SP medium
ad 1 l with H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
1 ml CaCl2 (0.5 M), sterilized by filtration
1 ml MnCl2 (10 mM) sterilized by filtration
2 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
LB medium
10 g Tryptone
5 g Yeast extract
10 g NaCl
if required, add 15 g agar for solid LB medium
ad 1 l with H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
C-Glc minimal medium
200 ml 5 x C salts
10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml III’ salts
25 ml Glucose (20%), autoclaved for 20 min at 121 °C
ad 1 l with sterile H2O
CE-Glc minimal medium
200 ml 5 x C salts
10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml III’ salts
20 ml Glutamate (40%)
25 ml Glucose (20%), autoclaved for 20 min at 121 °C
ad 1 l with sterile H2O
5 x C salts
20 g KH2PO4
80 g K2HPO4 x 3 H2O
16.5 g (NH4)2SO4
ad 1 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
III’ salts
0.232 g MnSO4 x 4 H2O
12.3 g MgSO4 x 7 H2O
ad 1 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
40% Glutamate solution
200 g L-Glutamic acid
adjust the pH to 7.0 by adding approximately 80 g KOH
ad 0.5 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
0.9% Saline (NaCl) solution
ad 1 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
50% Glycerol solution
295 ml Glycerol (87%)
ad 0.5 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
Bacteria (All strains are based on the Bacillus subtilis strain 168)
Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp)			Laboratory strain collection
Bacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-cfp)
Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp)
Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-yfp)