Мониторинг внутривидовой конкуренции в бактериальной популяции клеток путем кокултивации флуоресцентно маркированных штаммов

Summary

Бактерии могут накапливаться либо вредные или полезные мутации в течение своей жизни. В популяции клеток особи, накопившие полезные мутации, могут быстро переутомиться со своими собратьями. Здесь мы представляем простую процедуру визуализации внутривидовой конкуренции в популяции бактериальных клеток с течением времени с использованием флуоресцентно помечены лиц.

Abstract

Многие микроорганизмы, такие как бактерии размножаются очень быстро, и популяции могут достигать высокой плотности клеток. Небольшие фракции клеток в популяции всегда имеют накопленные мутации, которые являются либо вредными или полезными для клетки. Если фитнес-эффект мутации обеспечивает субпопуляцию с сильным селективным преимуществом роста, люди этой субпопуляции могут быстро переутомляться и даже полностью устранить своих непосредственных собратьев. Таким образом, небольшие генетические изменения и отборное накопление клеток, которые приобрели полезные мутации, могут привести к полному сдвигу генотипа клеточной популяции. Здесь мы представляем процедуру мониторинга быстрого клонального расширения и устранения полезных и вредных мутаций, соответственно, в популяции бактериальных клеток с течением времени путем кокултивации флуоресцентно помеченных особей грамположительных моделей бактерий Bacillus subtilis. Метод прост в работе и очень иллюстративно для отображения внутривидовой конкуренции между лицами в популяции бактериальных клеток.

Introduction

Почвенные бактерии, как правило, наделены гибкими регулирующими сетями и широкими метаболическими возможностями. Обе функции позволяют клеткам регулировать свои катаболические и анаболические пути, чтобы конкурировать со своими собратьями и другими микроорганизмами для питательных веществ, которые доступны в данной экологической^{нише 1}. Однако, если бактерии не в состоянии адаптироваться к окружающей среде другие механизмы могут объяснить выживание вида. Действительно, так как многие бактерии размножаются быстро и популяции могут достигать высокой плотности клеток субпопуляции, возможно, спонтанно накопленных полезных мутаций, которые обеспечивают клетки с селективным преимуществом роста и, следовательно, увеличить их пригодность. Кроме того, мутационные горячие точки и вызванный стрессом адаптивный мутагенез могут способствовать эволюции неадаптированных^{бактерий 2,3.} Таким образом, накопление мутаций и рост при непрерывном отборе является источником огромного микробного разнообразия, даже в пределах одного^{и того же рода 4,5.} Как и в природе, формирование бактериальных геномов также происходит в лаборатории из-за непрерывного культивирования под отбором. Об этом свидетельствует одомашнивания грамположительных бактерий B. subtilis, которая используется во всем мире в фундаментальных исследованиях и промышленности. В 1940-х годах B. subtilis был обработан ДНК-повреждающих рентгеновских лучей с последующим культивированием при определенном^{состоянии роста 6}. Мутации, которые накопились в бактериях во время их одомашнивания, обустраивания составляют потерю многих характеристик роста, т.е. лабораторный штамм B. subtilis 168 потерял способность формировать сложные^{колонии 7,8.}

В настоящее время для наиболее изученных моделей бактерий Escherichia coli и B. subtilis,различные мощные инструменты доступны для генетического манипулирования их геномами для решения конкретных научных вопросов. Иногда инактивация гена интереса вызывает серьезный дефект роста, который затем хорошо виден на стандартной среде роста^9. В отличие от этого, мутации, которые вызывают слабый дефект роста и, таким образом, лишь незначительно влияют на пригодность штамма часто игнорируются. Однако в обоих случаях длительная инкубация и пролет мутантных штаммов в течение нескольких поколений обычно приводят к накоплению мутантов-супрессоров, которые восстановили фенотип родительского^{штамма 2,9.} Характеристика мутантов-супрессоров и выявление мутаций, которые восстановили дефект роста родительского мутантного штамма, является очень полезным подходом, который позволяет прояснить важные и часто новые клеточные^{процессы 10,11}.

Мы заинтересованы в контроле глютамата гомеостаза в B. subtilis¹². Как и к кишечной палочке, B. subtilis реагирует на возмущение глютамата гомеостаза(т.е.блок^{в деградации глутамата 2}) путем накопления мутантов-супрессоров. Геномные изменения в этих мутантов супрессора, которые были приобретены спонтанной мутации было показано, быстро восстановить глютамат гомеостаз^9,13. Поэтому неудивительно, что адаптация B. subtilis к определенному состоянию роста во время одомашнивания бактерии отражается в синтезе ферментов и в развитых ферментных действиях, которые участвуют в метаболизме глутамата¹². Было высказано предположение, что отсутствие экзогенного глутамата в среде роста в процессе одомашнивания было движущей силой для появления и фиксации загадочного дегидрогеназы глутамата (GDH) gudB^{CR гена} в лабораторном штамме 168^2,14. Эта гипотеза подтверждается нашим наблюдением, что снижение количества активности GDH в лабораторном штамме обеспечивает бактериям селективное преимущество роста, когда экзогенный глутамат^{дефицитен 2}. Кроме того, культивирование штамма B. subtilis, синтезируя GDH GudB, при отсутствии экзогенного глутамата приводит к накоплению мутантов-супрессоров, которые инактивировали ген gudB ^2. Очевидно, что наличие катаболически активного GDH невыгодно для клетки, потому что эндогенно производства глутамата, которые могли бы быть использованы для анаболизма деградирует до аммония и 2-оксоглутарат (Рисунок 1). В отличие от этого, когда глутамат обеспечивается средой, штамм B. subtilis, оснащенный высокоуровневой активностью GDH, имеет избирательное преимущество роста по сравнению с штаммом, который синтезирует только один функциональный GDH. Разумно предположить, что активность ГДГ высокого уровня позволяет бактериям использовать глутамат в качестве второго источника углерода в дополнение к другим источникам углерода, предоставляемым^{средой 2 (см.} рисунок 1). Таким образом, активность ГДГ сильно влияет на пригодность бактерий, в зависимости от наличия экзогенного глутамата.

Здесь мы представляем очень иллюстративный метод мониторинга и визуализации внутривидовой конкуренции между двумя штаммами B. subtilis, которые отличаются одним локусом нахромосоме (рисунок 2). Эти два штамма были помечены генами yfp и cfp, кодирующих фторфоры YFP и CFP, и сокультивированы в различных условиях питания. Путем выборки с течением времени и путем покрытия соответствующих разбавлений на агарных пластинах выживших в каждой из культур можно было бы легко контролировать с помощью общего стерео флуоресценции микроскопа. Процедура, описанная в настоящем документе, проста в работе и подходит для визуализации быстрого расширения клонов и устранения полезных и вредных мутаций, соответственно, в популяции клеток с течением времени.

Protocol

1. Подготовка Агар плиты, культуры СМИ, Cryostocks, и прекультуры Подготовка средств роста и необходимых реагентов (см. таблицу материалов и реагентов). Полоса штаммов B. subtilis (например. BP40 (rocG- gudBCR amyE::PgudB-yfp) и BP52(rocG – gudB – amyE::PgudB…

Representative Results

Описанный здесь метод был успешно применен для визуализации внутривидовой конкуренции в популяции клеток, состоящей из штаммов B. subtilis, которые были помечены генами cfp и yfp, кодирующих фторфоры CFP и YFP, соответственно. Как показано на рисунке 3, метод может быть испо…

Discussion

Несколько методов были разработаны для анализа конкурентоспособной пригодности^{бактерий 16}. Во многих случаях бактерии были помечены различными кассетами устойчивости к антибиотикам¹⁷. Как и наш подход, маркировка клеток с помощью кассет с устойчивостью к антибиотикам позв…

Materials

(NH4)2SO4	Roth, Germany	3746	–
Agar	Difco, USA	214010	–
Ammonium ferric citrate (CAF)	Sigma-Aldrich, Germany	9714	–
CaCl2	Roth, Germany	5239	–
Glucose	Applichem, Germany	A3617	–
Glycerol	Roth, Germany	4043	–
K2HPO4 x 3 H2O	Roth, Germany	6878	–
KCl	Applichem, Germany	A3582	–
KH2PO4	Roth, Germany	3904	–
KOH	Roth, Germany	6751	–
MgSO4 x 7 H2O	Roth, Germany	P027	–
MnCl2	Roth, Germany	T881	–
MnSO4 x 4 H2O	Merck Millipore, Germany	102786	–
NaCl	Roth, Germany	9265	–
Nutrient broth	Roth, Germany	X929	–
Potassium glutamate	Applichem, Germany	A3712	–
Tryptone	Roth, Germany	8952	–
Tryptophan	Applichem, Germany	A3445	–
Yeast extract	Roth, Germany	2363	–
1.5 ml Reaction tubes	Sarstedt, Germany	72,690,001	–
2.0 ml Reaction tubes	Sarstedt, Germany	72,691	–
15 ml Plastic tubes with screw cap	Sarstedt, Germany	62,554,001	–
Petri dishes	Sarstedt, Germany	82.1473	–
1.5 ml Polystyrene cuvettes	Sarstedt, Germany	67,742	–
15 ml Glass culture tubes	Brand, Germany	7790 22	–
with aluminium caps
100 ml Shake flasks with aluminium caps	Brand, Germany	928 24	–
Sterile 10 ml glass pipettes	Brand, Germany	278 23	–
Incubator (28 and 37 °C)	New Brunswick	M1282-0012	–
Standard pipette set (2-20 μl, 10-100 μl, 100-1000 μl)	Eppendorf, Germany	4910 000.034, 4910 000.042,	–
		4910 000.042,
		4910 000.069
Table top centrifuge for 1.5 and 2 ml reaction tubes	Thermo Scientific, Heraeus Fresco 21, Germany	75002425	–
Table top centrifuge for 15 ml plastic tubes	Heraeus Biofuge Primo R, Germany	75005440	–
Standard spectrophotometer	Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, Germany	80-2112-21	–
Stereofluorescence microscope	Zeiss SteREO Lumar V12, Germany	495008-0009-000	–
Freezer (-20 and -80 °C)	–	–	–
Fridge (4 °C)	–	–	–
Autoclave	Zirbus, LTA 2x3x4, Germany	–	–
pH meter	pH-meter 766, Calimatic, Knick, Germany	766	–
Vortex	Vortex  3, IKA, Germany	3340000	–
Balance	CP2202S, Sartorius, Germany	replaced by	–
		CPA2202S
Black pen (permanent marker)	Staedler, Germany	317-9	–
Powerpoint program	Microsoft, USA	–	–
Office Excel program	Microsoft, USA	–	Program for data processing
Adobe Photoshop CS5	Adobe, USA	replaced by CS6, download	Computer program for image processing
Computer	PC or Mac	–	–
ZEN pro 2011 software for the stereofluorescence microscope	Zeiss, Germany	410135 1002 110	AxioCam MRc Rev. Obtained through Zeiss
Specific solution recipes
SP medium
8 g Nutrient broth
0.25 mg MgSO4 x 7 H2O
1 g KCl
if required, add 15 g agar for solid SP medium
ad 1 l with H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
1 ml CaCl2 (0.5 M), sterilized by filtration
1 ml MnCl2 (10 mM) sterilized by filtration
2 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
LB medium
10 g Tryptone
5 g Yeast extract
10 g NaCl
if required, add 15 g agar for solid LB medium
ad 1 l with H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
C-Glc minimal medium
200 ml 5 x C salts
10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml III’ salts
25 ml Glucose (20%), autoclaved for 20 min at 121 °C
ad 1 l with sterile H2O
CE-Glc minimal medium
200 ml 5 x C salts
10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml III’ salts
20 ml Glutamate (40%)
25 ml Glucose (20%), autoclaved for 20 min at 121 °C
ad 1 l with sterile H2O
5 x C salts
20 g KH2PO4
80 g K2HPO4 x 3 H2O
16.5 g (NH4)2SO4
ad 1 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
III’ salts
0.232 g MnSO4 x 4 H2O
12.3 g MgSO4 x 7 H2O
ad 1 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
40% Glutamate solution
200 g L-Glutamic acid
adjust the pH to 7.0 by adding approximately 80 g KOH
ad 0.5 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
0.9% Saline (NaCl) solution
ad 1 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
50% Glycerol solution
295 ml Glycerol (87%)
ad 0.5 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
Bacteria (All strains are based on the Bacillus subtilis strain 168)
Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp)			Laboratory strain collection
Bacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-cfp)
Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp)
Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-yfp)