חיידקים עשויים לצבור מוטציות מזיקות או מועילות במהלך חייהם. באוכלוסייה של תאים אנשים שצברו מוטציות מועילות עשויים במהירות עולים על חבריהם. כאן אנו מציגים הליך פשוט כדי לדמיין תחרות intraspecies באוכלוסיית תאים חיידקיים לאורך זמן באמצעות אנשים בעלי תווית פלואורסצנטית.
מיקרואורגניזמים רבים כגון חיידקים מתרבים מהר מאוד והאוכלוסיות עשויות להגיע לצפיפויות תאים גבוהות. שברים קטנים של תאים באוכלוסייה תמיד צברו מוטציות מזיקות או מועילות לתא. אם אפקט הכושר של מוטציה מספק תת-אוכלוסין עם יתרון צמיחה סלקטיבי חזק, האנשים של תת-אוכלוסיות זו עשויים במהירות outcompete ואפילו לחסל לחלוטין את חבריהם המיידיים. לכן, שינויים גנטיים קטנים הצטברות מונחה בחירה של תאים שרכשו מוטציות מועילות עלול להוביל לשינוי מוחלט של הגנוטיפ של אוכלוסיית התא. כאן אנו מציגים הליך כדי לפקח על התפשטות שיבוט מהירה וחיסול של מוטציות מועילות ומזיקות, בהתאמה, באוכלוסיית תאים חיידקיים לאורך זמן על ידי cocultivation של אנשים שכותרתו פלואורסצנטית של חיידק מודל גרם חיובי Bacillus subtilis. השיטה קלה לביצוע וממחישה מאוד כדי להציג תחרות intraspecies בקרב אנשים באוכלוסיית תאים חיידקיים.
חיידקי קרקע ניחנים בדרך כלל ברשתות רגולטוריות גמישות ויכולות מטבוליות רחבות. שתי התכונות מאפשרות לתאים להתאים את המסלולים הקטבוליים והאנאבוליים שלהם כדי להתחרות עם חבריהם ומיקרואורגניזמים אחרים עבור החומרים המזינים, הזמינים בנישה אקולוגית נתונה1. עם זאת, אם החיידקים אינם מסוגלים להסתגל לסביבתם מנגנונים אחרים עשויים להסביר את הישרדותו של מין. ואכן, כמו חיידקים רבים להתרבות מהר ואת האוכלוסיות יכול להגיע צפיפות תאים גבוהה תת-אוכלוסיות אולי צברו באופן ספונטני מוטציות מועילות המספקות לתאים יתרון גדילה סלקטיבי ולכן להגדיל את הכושר שלהם. יתר על כן, נקודות חמות מוטציה ו mutagenesis הסתגלות הנגרמת על ידי מתח יכול להקל על האבולוציה של חיידק לא מזוהה2,3. לכן, הצטברות של מוטציות וצמיחה תחת בחירה רציפה היא המקור למגוון המיקרוביאלי העצום, אפילו בתוך אותו סוג4,5. כמו בטבע, עיצוב של גנומים חיידקיים מתרחש גם במעבדה עקב טיפוח מתמשך תחת בחירה. הדבר בא לידי ביטוי בביות של החיידק גראם חיובי B. subtilis, אשר משמש ברחבי העולם במחקר בסיסי ובתעשייה. בשנות ה-40 של ה-40 טופלה סובטיליס בצילומי רנטגן מזיקים לדנ”א ולאחר מכן בטיפוח בתנאי צמיחה מסוימים6. המוטציות שהצטברו בחיידקים במהלך הביות שלהם מסבירות את אובדן מאפייני הגדילה הרבים, כלומר זן מעבדת B. subtilis 168 איבד את היכולת ליצור מושבות מורכבות7,8.
כיום, עבור חיידקי המודל הנחקרים ביותר Escherichia coli ו- B. subtilis, מגוון כלים רבי עוצמה זמינים לתפעל גנטית את הגנום שלהם כדי לענות על שאלות מדעיות ספציפיות. לפעמים חוסר ההשבתה של גן עניין גורם פגם צמיחה חמור, אשר לאחר מכן גלוי בבירור על מדיום צמיחה סטנדרטי9. לעומת זאת, לעתים קרובות מתעלמים ממוטציות הגורמות לפגם צמיחה חלש ובכך משפיעות רק במעט על כושר הזן. עם זאת, בשני המקרים דגירה ממושכת והעברת זנים מוטנטים במשך כמה דורות בדרך כלל לגרום הצטברות של מוטנטים מדכאים כי החזירו את הפנוטיפ של זן האב2,9. האפיון של מוטנטים מדכאים וזיהוי המוטציות שהחזירו את פגם הצמיחה של זן מוטנט האב היא גישה מועילה מאוד המאפשרת הבהרה של תהליכים תאיים חשובים ולעתים קרובות חדשניים10,11.
אנו מעוניינים בשליטה של הומאוסטזיס גלוטמט ב B. subtilis12. בדומה ל- E. coli, B. subtilis מגיב להטרדה של הומאוסטזיס גלוטמט (כלומרלחסום השפלה גלוטמט2) על ידי הצטברות של מוטנטים מדכאים. השינויים הגנומיים במוטנטים מדכאים אלה שנרכשו על ידי מוטציה ספונטנית הוכחו כמשקמים במהירות הומאוסטזיס גלוטמט9,13. לכן, אין זה מפתיע כי הסתגלות של B. subtilis למצב צמיחה ספציפי במהלך ביות של החיידק משתקף סינתזת אנזים ובפעילויות אנזימטיות התפתחו, אשר מעורבים בחילוף החומרים גלוטמט12. הוצע כי חוסר גלוטמט אקסוגני במדיום הצמיחה במהלך תהליך הביות היה הכוח המניע להופעת קיבעון של גלוטמט מסתורי דהידרוגנאז (GDH) gudBCR גן בזן המעבדה 1682,14. השערה זו נתמכת על ידי התצפית שלנו כי הכמות המופחתת של פעילות GDH בזן המעבדה מספקת לחיידקים יתרון גדילה סלקטיבי כאשר גלוטמט אקסוגני הוא נדיר2. יתר על כן, טיפוח של זן B. subtilis, סינתזה של GDH GudB, בהיעדר תוצאות גלוטמט אקסוגני הצטברות של מוטנטים מדכאים שהשביתו את הגן gudB 2. ברור, הנוכחות של GDH פעיל קטבולי הוא נחות עבור התא כי גלוטמט המיוצר באנדוגניות כי אחרת יכול לשמש אנבוליזם הוא מושפל אמוניום ו 2-oxoglutarate (איור 1). לעומת זאת, כאשר גלוטמט מסופק על ידי המדיום, זן B. subtilis מצויד בפעילות GDH ברמה גבוהה יש יתרון צמיחה סלקטיבית על פני זן כי מסנתז רק GDH פונקציונלי אחד. סביר להניח שפעילות GDH ברמה גבוהה מאפשרת לחיידקים להשתמש בגלוטמט כמקור פחמן שני בנוסף למקורות פחמן אחרים המסופקים על ידי המדיום2 (ראו איור 1). לכן, פעילות GDH משפיעה מאוד על כושר של חיידקים, בהתאם לזמינות של גלוטמט אקסוגני.
כאן אנו מציגים שיטה מאוד להמחשה כדי לנטר ולהמחיש תחרות תוך-מינית בין שני זנים של B. subtilis השונים במקום אחד על הכרומוזום (איור 2). שני הזנים סומנו עם הגנים yfp ו- cfp המקודדים את YFP ו- CFP פלואורופורים, ו cocultivated בתנאים תזונתיים שונים. על ידי דגימה לאורך זמן ועל ידי ציפוי דילול מתאים על צלחות אגר הניצולים בכל אחת מהתרבויות ניתן לפקח בקלות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו נפוץ. ההליך המתואר במאמר זה קל לביצוע ומתאים לדמיין את ההתפשטות המהירה של שיבוט וחיסול מוטציות מועילות ומזיקות, בהתאמה, באוכלוסיית תאים לאורך זמן.
מספר שיטות פותחו כדי לנתח כושר תחרותי שלחיידקים 16. במקרים רבים החיידקים תויגו עם קלטות עמידות לאנטיביוטיקה שונות17. בדומה לגישה שלנו, תיוג התאים עם קלטות עמידות לאנטיביוטיקה מאפשר הערכה של כושר תחרותי של החיידקים במהלך cocultivation בתנאי גדילה מוגדרים. יתר על כן, שיטה זו יכולה לשמש כ…
The authors have nothing to disclose.
העבודה במעבדת המחברים נתמכה על ידי דויטשה פורסונגסג’מינשפט (http://www.dfg.de; CO 1139/1-1), פונדס דר Chemischen Industrie (http://www.vci.de/fonds), ומרכז גטינגן לביולוגיה מולקולרית (GZMB). המחברים מבקשים להכיר יורג Stülke עבור הערות מועילות וקריאה ביקורתית של כתב היד.
(NH4)2SO4 | Roth, Germany | 3746 | – |
Agar | Difco, USA | 214010 | – |
Ammonium ferric citrate (CAF) | Sigma-Aldrich, Germany | 9714 | – |
CaCl2 | Roth, Germany | 5239 | – |
Glucose | Applichem, Germany | A3617 | – |
Glycerol | Roth, Germany | 4043 | – |
K2HPO4 x 3 H2O | Roth, Germany | 6878 | – |
KCl | Applichem, Germany | A3582 | – |
KH2PO4 | Roth, Germany | 3904 | – |
KOH | Roth, Germany | 6751 | – |
MgSO4 x 7 H2O | Roth, Germany | P027 | – |
MnCl2 | Roth, Germany | T881 | – |
MnSO4 x 4 H2O | Merck Millipore, Germany | 102786 | – |
NaCl | Roth, Germany | 9265 | – |
Nutrient broth | Roth, Germany | X929 | – |
Potassium glutamate | Applichem, Germany | A3712 | – |
Tryptone | Roth, Germany | 8952 | – |
Tryptophan | Applichem, Germany | A3445 | – |
Yeast extract | Roth, Germany | 2363 | – |
1.5 ml Reaction tubes | Sarstedt, Germany | 72,690,001 | – |
2.0 ml Reaction tubes | Sarstedt, Germany | 72,691 | – |
15 ml Plastic tubes with screw cap | Sarstedt, Germany | 62,554,001 | – |
Petri dishes | Sarstedt, Germany | 82.1473 | – |
1.5 ml Polystyrene cuvettes | Sarstedt, Germany | 67,742 | – |
15 ml Glass culture tubes | Brand, Germany | 7790 22 | – |
with aluminium caps | |||
100 ml Shake flasks with aluminium caps | Brand, Germany | 928 24 | – |
Sterile 10 ml glass pipettes | Brand, Germany | 278 23 | – |
Incubator (28 and 37 °C) | New Brunswick | M1282-0012 | – |
Standard pipette set (2-20 μl, 10-100 μl, 100-1000 μl) | Eppendorf, Germany | 4910 000.034, 4910 000.042, | – |
4910 000.042, | |||
4910 000.069 | |||
Table top centrifuge for 1.5 and 2 ml reaction tubes | Thermo Scientific, Heraeus Fresco 21, Germany | 75002425 | – |
Table top centrifuge for 15 ml plastic tubes | Heraeus Biofuge Primo R, Germany | 75005440 | – |
Standard spectrophotometer | Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, Germany | 80-2112-21 | – |
Stereofluorescence microscope | Zeiss SteREO Lumar V12, Germany | 495008-0009-000 | – |
Freezer (-20 and -80 °C) | – | – | – |
Fridge (4 °C) | – | – | – |
Autoclave | Zirbus, LTA 2x3x4, Germany | – | – |
pH meter | pH-meter 766, Calimatic, Knick, Germany | 766 | – |
Vortex | Vortex 3, IKA, Germany | 3340000 | – |
Balance | CP2202S, Sartorius, Germany | replaced by | – |
CPA2202S | |||
Black pen (permanent marker) | Staedler, Germany | 317-9 | – |
Powerpoint program | Microsoft, USA | – | – |
Office Excel program | Microsoft, USA | – | Program for data processing |
Adobe Photoshop CS5 | Adobe, USA | replaced by CS6, download | Computer program for image processing |
Computer | PC or Mac | – | – |
ZEN pro 2011 software for the stereofluorescence microscope | Zeiss, Germany | 410135 1002 110 | AxioCam MRc Rev. Obtained through Zeiss |
Specific solution recipes | |||
SP medium | |||
8 g Nutrient broth | |||
0.25 mg MgSO4 x 7 H2O | |||
1 g KCl | |||
if required, add 15 g agar for solid SP medium | |||
ad 1 l with H2O, autoclave for 20 min at 121 °C | |||
1 ml CaCl2 (0.5 M), sterilized by filtration | |||
1 ml MnCl2 (10 mM) sterilized by filtration | |||
2 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration | |||
LB medium | |||
10 g Tryptone | |||
5 g Yeast extract | |||
10 g NaCl | |||
if required, add 15 g agar for solid LB medium | |||
ad 1 l with H2O, autoclave for 20 min at 121 °C | |||
C-Glc minimal medium | |||
200 ml 5 x C salts | |||
10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration | |||
10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration | |||
10 ml III’ salts | |||
25 ml Glucose (20%), autoclaved for 20 min at 121 °C | |||
ad 1 l with sterile H2O | |||
CE-Glc minimal medium | |||
200 ml 5 x C salts | |||
10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration | |||
10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration | |||
10 ml III’ salts | |||
20 ml Glutamate (40%) | |||
25 ml Glucose (20%), autoclaved for 20 min at 121 °C | |||
ad 1 l with sterile H2O | |||
5 x C salts | |||
20 g KH2PO4 | |||
80 g K2HPO4 x 3 H2O | |||
16.5 g (NH4)2SO4 | |||
ad 1 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C | |||
III’ salts | |||
0.232 g MnSO4 x 4 H2O | |||
12.3 g MgSO4 x 7 H2O | |||
ad 1 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C | |||
40% Glutamate solution | |||
200 g L-Glutamic acid | |||
adjust the pH to 7.0 by adding approximately 80 g KOH | |||
ad 0.5 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C | |||
0.9% Saline (NaCl) solution | |||
ad 1 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C | |||
50% Glycerol solution | |||
295 ml Glycerol (87%) | |||
ad 0.5 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C | |||
Bacteria (All strains are based on the Bacillus subtilis strain 168) | |||
Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp) | Laboratory strain collection | ||
Bacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-cfp) | |||
Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp) | |||
Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-yfp) |