Monitoreo De La Competencia Intraespecies En Una Población De Células Bacterianas Por Cocultivación De Cepas Marcadas Fluorescentemente

Summary

Las bacterias pueden acumular mutaciones perjudiciales o beneficiosas durante su vida. En una población de células, los individuos que han acumulado mutaciones beneficiosas pueden superar rápidamente a sus semejantes. Aquí presentamos un procedimiento simple para visualizar la competencia intraespecies en una población de células bacterianas a lo largo del tiempo utilizando individuos marcados fluorescentemente.

Abstract

Muchos microorganismos como las bacterias proliferan extremadamente rápido y las poblaciones pueden alcanzar altas densidades celulares. Pequeñas fracciones de células en una población siempre tienen mutaciones acumuladas que son perjudiciales o beneficiosas para la célula. Si el efecto de aptitud de una mutación proporciona a la subpoblación una fuerte ventaja de crecimiento selectivo, los individuos de esta subpoblación pueden superar rápidamente e incluso eliminar por completo a sus compañeros inmediatos. Así, los pequeños cambios genéticos y la acumulación selección-impulsada de células que han adquirido mutaciones beneficiosas pueden llevar a un cambio completo del genotipo de una población de la célula. Aquí presentamos un procedimiento para supervisar la rápida expansión clonal y la eliminación de mutaciones beneficiosas y perjudiciales, respectivamente, en una población celular bacteriana a lo largo del tiempo por cocultivación de individuos marcados fluorescentemente de la bacteria modelo Gram-positiva Bacillus subtilis. El método es fácil de realizar y muy ilustrativo para mostrar la competencia intraespecies entre los individuos en una población celular bacteriana.

Introduction

Las bacterias del suelo suelen estar dotadas de redes reguladoras flexibles y amplias capacidades metabólicas. Ambas características permiten a las células ajustar sus vías catabólicas y anabólicas para competir con sus compañeros y otros microorganismos por los nutrientes, que están disponibles en un nicho ecológico dado¹. Sin embargo, si las bacterias son incapaces de adaptarse a su entorno, otros mecanismos pueden explicar la supervivencia de una especie. De hecho, como muchas bacterias proliferan rápidamente y las poblaciones pueden alcanzar altas densidades celulares, las subpoblaciones pueden haber acumulado espontáneamente mutaciones beneficiosas que proporcionan a las células una ventaja de crecimiento selectivo y, por lo tanto, aumentan su aptitud. Además, los puntos críticos mutacionales y la mutagénesis adaptativa inducida por el estrés pueden facilitar la evolución de una bacteria inadaptada^2,3. Así, la acumulación de mutaciones y el crecimiento bajo selección continua es el origen de la enorme diversidad microbiana, incluso dentro del mismo género^4,5. Al igual que en la naturaleza, la conformación de genomas bacterianos también ocurre en el laboratorio debido al cultivo continuo bajo selección. Esto se ejemplifica en la domesticación de la bacteria Gram-positiva B. subtilis, que se utiliza en todo el mundo en la investigación básica y en la industria. En la década de 1940, B. subtilis fue tratado con rayos X perjudiciales para el ADN, seguidos de un cultivo bajo una condición de crecimiento específica^6. Las mutaciones que se han acumulado en las bacterias durante su domesticación explican la pérdida de muchas características de crecimiento, es decir, la cepa de laboratorio B. subtilis 168 perdió la capacidad de formar colonias complejas^7,8.

Hoy en día, para las bacterias modelo mejor estudiadas Escherichia coli y B. subtilis,una variedad de herramientas poderosas está disponible para manipular genéticamente sus genomas con el fin de abordar cuestiones científicas específicas. A veces la inactivación de un gen de interés causa un defecto de crecimiento severo, que luego es claramente visible en el medio de crecimiento estándar⁹. Por el contrario, las mutaciones que causan un defecto de crecimiento débil y, por lo tanto, solo afectan ligeramente la aptitud de la cepa a menudo se ignoran. Sin embargo, en ambos casos la incubación prolongada y el paso de las cepas mutantes durante varias generaciones suelen dar lugar a la acumulación de mutantes supresores que han restaurado el fenotipo de la cepa madre^2,9. La caracterización de mutantes supresores y la identificación de las mutaciones que han restaurado el defecto de crecimiento de la cepa mutante madre es un enfoque muy útil que permite la elucidación de procesos celulares importantes y a menudo^{novedosos 10,11.}

Estamos interesados en el control de la homeostasis del glutamato en B. subtilis^12. Similar a E. coli, B. subtilis responde a la perturbación de la homeostasis del glutamato(es decir,bloqueo en la degradación del glutamato²⁾por la acumulación de mutantes supresores. Se demostró que las alteraciones genómicas en estos mutantes supresores que fueron adquiridos por mutación espontánea restauran rápidamente la homeostasis del glutamato^9,13. Por lo tanto, no es sorprendente que la adaptación de B. subtilis a una condición de crecimiento específica durante la domesticación de la bacteria se refleje en la síntesis enzimática y en las actividades enzimáticas evolucionadas, que están involucradas en el metabolismo del glutamato^12. Se ha sugerido que la falta de glutamato exógeno en el medio de crecimiento durante el proceso de domesticación fue la fuerza impulsora para la aparición y fijación de la críptica glutamato deshidrogenasa (GDH) del gen GUDB^CR en la cepa de laboratorio 168^2,14. Esta hipótesis es apoyada por nuestra observación de que la cantidad reducida de actividad de GDH en la cepa de laboratorio proporciona a las bacterias una ventaja de crecimiento selectivo cuando el glutamato exógeno es escaso^2. Por otra parte, el cultivo de una cepa de B. subtilis, sintetizando el GDH GudB, en ausencia de glutamato exógeno da lugar a la acumulación de mutantes supresores que han inactivado el gen gudB ^2. Obviamente, la presencia de un GDH catabólicamente activo es desventajosa para la célula porque el glutamato producido endógenamente que de otra manera podría ser utilizado para el anabolismo se degrada a amonio y 2-oxoglutarato(Figura 1). Por el contrario, cuando el glutamato es proporcionado por el medio, una cepa de B. subtilis equipada con actividad GDH de alto nivel tiene una ventaja de crecimiento selectivo sobre una cepa que sintetiza solo un GDH funcional. Es razonable suponer que la actividad de GDH de alto nivel permite a las bacterias utilizar el glutamato como segunda fuente de carbono además de otras fuentes de carbono proporcionadas por el medio² (ver Figura 1). Por lo tanto, la actividad de GDH afecta fuertemente la aptitud de las bacterias, dependiendo de la disponibilidad de glutamato exógeno.

Aquí presentamos un método muy ilustrativo para monitorear y visualizar la competencia intraespecípecíta entre dos cepas de B. subtilis que difieren en un solo lugar geométrico en el cromosoma(Figura 2). Las dos cepas fueron etiquetadas con los genes yfp y cfp que codifican los fluoróforos YFP y CFP, y cocultivadas bajo diferentes condiciones nutricionales. Mediante el muestreo a lo largo del tiempo y el enchapado de diluciones apropiadas en placas de agar, los sobrevivientes en cada uno de los cultivos podrían ser fácilmente monitoreados utilizando un microscopio de fluorescencia estéreo común. El procedimiento descrito en este papel es fácil de realizar y conveniente visualizar la extensión y la eliminación clónicas rápidas de mutaciones beneficiosas y perjudiciales, respectivamente, en una población de la célula en un cierto plazo.

Protocol

1. Preparación de placas de agar, medios de cultivo, criostocks y precultivos Prepare los medios de crecimiento y los reactivos requeridos (ver tabla de materiales y reactivos). Raya las cepas de B. subtilis (por ejemplo. BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp) y BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp) expresando uno y dos GDHs activos, respectivamente)2 que…

Representative Results

El método descrito aquí se aplicó con éxito para visualizar la competencia intraespecies en una población celular que consiste en cepas de B. subtilis que fueron etiquetados con los genes cfp e yfp que codifican los fluoróforos CFP y YFP, respectivamente. Como se muestra en la Figura 3,el método se puede utilizar para visualizar la competencia intraespecies de una manera muy ilustrativa. Al detectar las muestras en áreas pequeñas, la composición clonal de la població…

Discussion

Se han desarrollado varios métodos para analizar la aptitud competitiva de las bacterias¹⁶. En muchos casos las bacterias fueron etiquetadas con diferentes casetes de resistencia a los antibióticos¹⁷. Similar a nuestro enfoque, el etiquetado de las células con casetes de resistencia a antibióticos permite la evaluación de la aptitud competitiva de las bacterias durante el cocultivo en condiciones de crecimiento definidas. Por otra parte, este método se puede utilizar para determinar la aptitud…

Materials

(NH4)2SO4	Roth, Germany	3746	–
Agar	Difco, USA	214010	–
Ammonium ferric citrate (CAF)	Sigma-Aldrich, Germany	9714	–
CaCl2	Roth, Germany	5239	–
Glucose	Applichem, Germany	A3617	–
Glycerol	Roth, Germany	4043	–
K2HPO4 x 3 H2O	Roth, Germany	6878	–
KCl	Applichem, Germany	A3582	–
KH2PO4	Roth, Germany	3904	–
KOH	Roth, Germany	6751	–
MgSO4 x 7 H2O	Roth, Germany	P027	–
MnCl2	Roth, Germany	T881	–
MnSO4 x 4 H2O	Merck Millipore, Germany	102786	–
NaCl	Roth, Germany	9265	–
Nutrient broth	Roth, Germany	X929	–
Potassium glutamate	Applichem, Germany	A3712	–
Tryptone	Roth, Germany	8952	–
Tryptophan	Applichem, Germany	A3445	–
Yeast extract	Roth, Germany	2363	–
1.5 ml Reaction tubes	Sarstedt, Germany	72,690,001	–
2.0 ml Reaction tubes	Sarstedt, Germany	72,691	–
15 ml Plastic tubes with screw cap	Sarstedt, Germany	62,554,001	–
Petri dishes	Sarstedt, Germany	82.1473	–
1.5 ml Polystyrene cuvettes	Sarstedt, Germany	67,742	–
15 ml Glass culture tubes	Brand, Germany	7790 22	–
with aluminium caps
100 ml Shake flasks with aluminium caps	Brand, Germany	928 24	–
Sterile 10 ml glass pipettes	Brand, Germany	278 23	–
Incubator (28 and 37 °C)	New Brunswick	M1282-0012	–
Standard pipette set (2-20 μl, 10-100 μl, 100-1000 μl)	Eppendorf, Germany	4910 000.034, 4910 000.042,	–
		4910 000.042,
		4910 000.069
Table top centrifuge for 1.5 and 2 ml reaction tubes	Thermo Scientific, Heraeus Fresco 21, Germany	75002425	–
Table top centrifuge for 15 ml plastic tubes	Heraeus Biofuge Primo R, Germany	75005440	–
Standard spectrophotometer	Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, Germany	80-2112-21	–
Stereofluorescence microscope	Zeiss SteREO Lumar V12, Germany	495008-0009-000	–
Freezer (-20 and -80 °C)	–	–	–
Fridge (4 °C)	–	–	–
Autoclave	Zirbus, LTA 2x3x4, Germany	–	–
pH meter	pH-meter 766, Calimatic, Knick, Germany	766	–
Vortex	Vortex  3, IKA, Germany	3340000	–
Balance	CP2202S, Sartorius, Germany	replaced by	–
		CPA2202S
Black pen (permanent marker)	Staedler, Germany	317-9	–
Powerpoint program	Microsoft, USA	–	–
Office Excel program	Microsoft, USA	–	Program for data processing
Adobe Photoshop CS5	Adobe, USA	replaced by CS6, download	Computer program for image processing
Computer	PC or Mac	–	–
ZEN pro 2011 software for the stereofluorescence microscope	Zeiss, Germany	410135 1002 110	AxioCam MRc Rev. Obtained through Zeiss
Specific solution recipes
SP medium
8 g Nutrient broth
0.25 mg MgSO4 x 7 H2O
1 g KCl
if required, add 15 g agar for solid SP medium
ad 1 l with H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
1 ml CaCl2 (0.5 M), sterilized by filtration
1 ml MnCl2 (10 mM) sterilized by filtration
2 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
LB medium
10 g Tryptone
5 g Yeast extract
10 g NaCl
if required, add 15 g agar for solid LB medium
ad 1 l with H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
C-Glc minimal medium
200 ml 5 x C salts
10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml III’ salts
25 ml Glucose (20%), autoclaved for 20 min at 121 °C
ad 1 l with sterile H2O
CE-Glc minimal medium
200 ml 5 x C salts
10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml III’ salts
20 ml Glutamate (40%)
25 ml Glucose (20%), autoclaved for 20 min at 121 °C
ad 1 l with sterile H2O
5 x C salts
20 g KH2PO4
80 g K2HPO4 x 3 H2O
16.5 g (NH4)2SO4
ad 1 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
III’ salts
0.232 g MnSO4 x 4 H2O
12.3 g MgSO4 x 7 H2O
ad 1 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
40% Glutamate solution
200 g L-Glutamic acid
adjust the pH to 7.0 by adding approximately 80 g KOH
ad 0.5 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
0.9% Saline (NaCl) solution
ad 1 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
50% Glycerol solution
295 ml Glycerol (87%)
ad 0.5 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
Bacteria (All strains are based on the Bacillus subtilis strain 168)
Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp)			Laboratory strain collection
Bacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-cfp)
Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp)
Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-yfp)