القبض على ببتيد سكري لخلية سطح البروتينات
Summary
بروتينات سطح الخلية مهمة من الناحية البيولوجية والغليكوزيلاتي على نطاق واسع. ونحن نقدم هنا نهج ببتيد سكري التقاط لذوبان، وإثراء، وdeglycosylate هذه البروتينات لتحليلات البروتين السهل LC-MS القائمة.
Abstract
بروتينات سطح الخلية، بما في ذلك البروتينات المصفوفة خارج الخلية، والمشاركة في جميع العمليات والوظائف الخلوية الرئيسية، مثل النمو، والتمايز، والانتشار. توصيف شامل لهذه البروتينات يوفر معلومات غنية لاكتشاف العلامات البيولوجية، خلية من نوع تحديد الهوية، واختيار المستهدفة المخدرات، وكذلك المساعدة على تطوير فهمنا لعلم الأحياء الخلوي وعلم وظائف الأعضاء. البروتينات السطحية، ومع ذلك، تشكل تحديات كبيرة التحليلية، وذلك بسبب وفرة منخفضة بطبيعتها، للا مائية عالية، والتعديلات بعد متعدية الثقيلة. الاستفادة من ارتباط بالغليكوزيل انتشارا على سطح البروتينات، ونحن نقدم هنا نهج ببتيد سكري التقاط الإنتاجية العالية التي تدمج مزايا عدة N-glycoproteomics الوسائل المتاحة. يمكن أسلوبنا إثراء glycopeptides المستمدة من البروتينات السطحية وإزالة glycans من أجل البروتينات السطحية باستخدام LC-MS. تضم حلها N-glycoproteome على الوقود النووي المشعormation من هوية البروتين وكمية وكذلك مواقعهم من ارتباط بالغليكوزيل. وقد تم تطبيق هذا الأسلوب لسلسلة من الدراسات في المناطق بما في ذلك السرطان، والخلايا الجذعية، وسمية الدواء. الحد من الأسلوب يكمن في وفرة منخفضة من البروتينات الغشاء السطح، بحيث كمية كبيرة نسبيا من العينات المطلوبة لهذا التحليل مقارنة مع الدراسات التي تركز على البروتينات عصاري خلوي.
Introduction
بروتينات سطح الخلية تتفاعل مع البيئة خارج الخلية والتي ستحول الاشارات من الخارج إلى داخل الخلية. وبالتالي، هذه البروتينات، بما في ذلك البروتينات المصفوفة خارج الخلية، وتلعب أدوارا حاسمة في جميع جوانب البيولوجيا الخلوية وعلم وظائف الأعضاء بدءا من الانتشار والنمو، والهجرة، والتمايز إلى الشيخوخة وهكذا دواليك. البروتينات السطحية تعمل من خلال التفاعل مع الخلايا الأخرى، والبروتينات والجزيئات الصغيرة 1-3. التوصيف الجزيئي للبروتينات سطح الخلية هي ذات أهمية كبيرة ليس فقط لعلماء الأحياء ولكن أيضا لشركات الأدوية، كما يتم استهداف أكثر من 60٪ من الأدوية لبروتينات سطح الخلية 4.
جنبا إلى جنب مطياف الكتلة (MS)، مع حساسيتها الفائقة والدقة والإنتاجية لتحديد البروتينات والببتيدات كانت، أداة قوية لدراسات البروتين 5،6 العالمية. حتى الآن، والبروتينات السطحية تشكل تحديات كبيرة لالبروتيوميات يستند إلى MS-، ووتوجد معظم البروتينات السطحية بكميات منخفضة ومع التعديلات الثقيلة. المناطق التي تمتد غشاء من البروتينات السطحية جعلها مسعور؛ هذا هو الحال بالنسبة للبروتينات عبر الغشاء المتعددة الدخول على وجه الخصوص. بالتالي فمن الصعب حل بروتينات الغشاء في المحاليل المائية دون مساعدة من المنظفات؛ ولكن استخدام المنظفات يقمع عموما أداء HPLC وMS 1،7،8 في تحديد البروتين. وبالتالي، بروتينات غشاء اتسمت ضعيفا في البروتينات المباشرة القائمة LC-MS.
ارتباط بالغليكوزيل هي واحدة من التعديلات بعد متعدية أهم وفيرة تجري في البروتينات على سطح الخلية 9. التعقيد الهائل وعدم التجانس من glycans تعوق الببتيدات 'MS إشارة 10. ومع ذلك، قد استخدمت عدة أساليب البروتين هذا التعديل فريدة من نوعها لإثراء البروتينات السطحية والأنصاف لإزالة السكر من البروتينات قبل تحليل LC-MS. هذه الطريقةو تشمل القائمة على كتين القبض على تقارب 11 ومقرها حمض البوريك أو التقاط الكيميائية المستندة إلى هيدرازيد 12 وكذلك فصل اللوني ماء 8،13. إزالة glycans يحول البروتينات الغشاء إلى البروتينات العادية ويبسط توصيف MS بشكل كبير. بسبب ارتباط بالغليكوزيل أيضا يحدث في البروتينات يفرز التي لديها القابلية للذوبان عالية على النقيض من غشاء بروتينات، يتم تحسين العديد من الطرق لglycoproteomic البروتينات القابلة للذوبان، وتميل إلى أن تكون أقل الانتقائية ببتيد سكري وحساسية عندما يتم نشرهم في غشاء بروتينات 8،14. توجد أساليب أخرى أيضا لإثراء، على وجه الخصوص، البروتينات على سطح الخلية، مثل تلك التي تستخدم تنبيذ فائق 15 واستراتيجيات التوسيم 16. وقد أجريت مقارنة تفصيلية بين طريقتنا والأساليب القائمة الأخرى لوصف البروتينات الغشاء مؤخرا 17، وأشارت النتائج إلى أن طريقة لدينا يمكن أن تؤدي بشكل جيد على قدم المساواة، إن لم يكنأفضل، من جميع الطرق البروتينات الغشاء مقارنة، ولكن مع ارتفاع البساطة.
للمساعدة في استخدام هذه الطريقة الباحثين، ونحن هنا بالتفصيل بروتوكول عام. هذا الأسلوب يدمج العديد من المزايا استراتيجيات glycoproteomics القائمة وضعت خصيصا للبروتينات سكرية الغشاء، إلا أن الأسلوب يعمل بشكل جيد على قدم المساواة للبروتينات يفرزها. خصائص هذا الأسلوب ما يلي: 1) الانحلالية كاملة من البروتينات الغشاء، 2) إثراء glycopeptides بدلا من بروتينات سكرية للقضاء على عائق الفراغية المحتملة عند استخدام اسر الركيزة الصلبة، 3) استخدام الكيمياء هيدرازيد لتكوين روابط تساهمية بين glycopeptides والركيزة اسر، مثل أن glycopeptides المستعبدين يمكن أن يتسامح يغسل صرامة لglycoselectivity عالية، و 4) القدرة على إجراء الإجراء التقاط بأكمله في أنبوب واحد لتخفيض فقدان العينة وتقصير مدة الإجراءات. بعد تنفيذ هذا الأسلوب لدراسة فاريإيتي من العينات البيولوجية بما في ذلك الخلايا والأنسجة، لاحظنا انتقائية عالية (> 90٪) لبروتينات سكرية 8،17،18.
Protocol
Representative Results
Discussion
ونحن هنا نقدم استراتيجية ببتيد سكري التقاط لالتنميط بروتينات سطح الخلية. طريقة يمكن تطبيقها على دراسة بروتينات يفرزها، مثل تلك الموجودة في الدم، وكذلك في سوائل الجسم الأخرى أو في الخلية سائل الإعلام والثقافة.
نجاح الأسلوب يعتمد…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا البحث من قبل صندوق بدء التشغيل من جامعة سايمون فريزر.
Materials
| DTT | Sigma | 646563 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Iodoacetamide | Sigma | A3221 | |
| Rapigest SF | Waters | 186001860 | |
| Sodium periodate | Sigma | 311448 | |
| PNGase F | New England Biolabs | P0704S | |
| Affi-Gel Hz Hydrazide gel | Bio-Rad | 153-6047 | |
| Trypsin | Worthington Biomedical | LS02115 | |
| Sep-Pak C-18 cartridge | Waters | WAT054955 | |
| Oasis MCX cartridge | Waters | 186000252 | |
| Protease inhibitor coctail | Sigma | P8340 | |
| Urea | Amersco | 568 | |
| Sodium sulphite | Caledon | 8360-1 | |
| Invertase | Sigma | I0408 | |
| Alpha-1 trypsin | Sigma | F2006 | |
| Ribonulease B | Sigma | R7884 | |
| Avidin | Sigma | A9275 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Conalbumin | Sigma | C0755 |
References
- Cho, W., Stahelin, R. V. Membrane-protein interactions in cell signaling and membrane trafficking. Annual review of biophysics and biomolecular structure. 34, 119-151 (2005).
- Tadevosyan, A., Vaniotis, G., Allen, B. G., Hebert, T. E., Nattel, S. G. protein-coupled receptor signalling in the cardiac nuclear membrane: evidence and possible roles in physiological and pathophysiological function. The Journal of physiology. 590, 1313-1330 (2012).
- White, S. H. Biophysical dissection of membrane proteins. Nature. 459, 344-346 (2009).
- Heijne, G. Membrane-protein topology. . Nature reviews Molecular cell biology. 7, 909-918 (2006).
- Cox, J., Mann, M. Quantitative high-resolution proteomics for data-driven systems biology. Annual review of biochemistry. 80, 273-299 (2011).
- Lamond, A. I., et al. Advancing cell biology through proteomics in space and time (PROSPECTS). Mol Cell Proteomics. 11, (2012).
- Savas, J. N., Stein, B. D., Wu, C. C., Yates 3rd, J. R. Mass spectrometry accelerates membrane protein analysis. Trends in biochemical sciences. 36, 388-396 (2011).
- Sun, B., et al. Shotgun glycopeptide capture approach coupled with mass spectrometry for comprehensive glycoproteomics. Mol Cell Proteomics. 6, 141-149 (2007).
- Lowe, J. B. Glycosylation, immunity, and autoimmunity. Cell. 104, 809-812 (2001).
- Dodds, E. D. Gas-phase dissociation of glycosylated peptide ions. Mass spectrometry reviews. 31, 666-682 (2012).
- Kaji, H., et al. Lectin affinity capture, isotope-coded tagging and mass spectrometry to identify N-linked glycoproteins. Nat Biotechnol. 21, 667-672 (2003).
- Zhang, H., Li, X. J., Martin, D. B., Aebersold, R. Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry. Nat Biotechnol. 21, 660-666 (2003).
- Hagglund, P., Bunkenborg, J., Elortza, F., Jensen, O. N., Roepstorff, P. A new strategy for identification of N-glycosylated proteins and unambiguous assignment of their glycosylation sites using HILIC enrichment and partial deglycosylation. J Proteome Res. 3, 556-566 (2004).
- Bond, M. R., Kohler, J. J. Chemical methods for glycoprotein discovery. Current opinion in chemical biology. 11, 52-58 (2007).
- Pasini, E. M., et al. In-depth analysis of the membrane and cytosolic proteome of red blood cells. Blood. 108, 791-801 (2006).
- Wollscheid, B., et al. Mass-spectrometric identification and relative quantification of N-linked cell surface glycoproteins. Nat Biotechnol. 27, 378-386 (2009).
- Sun, B., et al. N-Glycoproteome of E14.Tg2a mouse embryonic stem cells. PLoS ONE. 8, (2013).
- Sun, B., et al. Glycocapture-assisted global quantitative proteomics (gagQP) reveals multiorgan responses in serum toxicoproteome. J Proteome Res. 12, 2034-2044 (2013).
