Captura Glicopéptido Proteómica Superficie Celular

Summary

Proteínas de la superficie celular son biológicamente importantes y ampliamente glicosilada. Presentamos aquí un enfoque glucopéptidos captura para solubilizar, enriquecer y deglycosylate estas proteínas para análisis proteómicos fáciles LC-MS basados.

Abstract

Proteínas de superficie celular, incluyendo las proteínas de la matriz extracelular, participan en todos los principales procesos y funciones celulares, tales como el crecimiento, la diferenciación y la proliferación. Una caracterización completa de estas proteínas proporciona una rica información para el descubrimiento de biomarcadores, la identificación del tipo de célula, y la selección de medicamentos-objetivo, así como ayudar a avanzar en nuestra comprensión de la biología celular y fisiología. Proteínas de superficie, sin embargo, plantean desafíos analíticos significativos, debido a su inherente baja abundancia, alta hidrofobicidad, y las modificaciones posteriores a la traducción pesados. Tomando ventaja de la glicosilación prevalente en proteínas de la superficie, se introduce aquí un enfoque glicopéptido de captura de alto rendimiento que integra las ventajas de varios medios N-glycoproteomics existentes. Nuestro método puede enriquecer los glicopéptidos derivados de proteínas de la superficie y retire sus glicanos para proteómica fáciles utilizando LC-MS. La N-glicoproteoma resuelto comprende la información de la identidad y la cantidad de proteínas, así como sus sitios de glicosilación. Este método se ha aplicado a una serie de estudios en áreas que incluyen el cáncer, las células madre, y la toxicidad del fármaco. La limitación del método radica en la baja abundancia de proteínas de la membrana de superficie, de tal manera que se requiere una cantidad relativamente grande de muestras para este análisis en comparación con estudios centrados en las proteínas citosólicas.

Introduction

Proteínas de superficie celular interactúan con el medio ambiente extracelular y transmiten señales desde el exterior al interior de una célula. Por lo tanto, estas proteínas, incluyendo las proteínas de la matriz extracelular, desempeñan papeles críticos en todos los aspectos de la biología celular y la fisiología que van desde la proliferación, el crecimiento, la migración, la diferenciación al envejecimiento y así sucesivamente. Proteínas de superficie funcionan mediante la interacción con otras células, proteínas y moléculas pequeñas ^1-3. La caracterización molecular de las proteínas de la superficie celular es de gran interés no sólo para los biólogos sino también para las empresas farmacéuticas, ya que más del 60% de los medicamentos están dirigidos a las proteínas de la superficie celular ^4.

Espectrometría de masas tándem (MS), con su sensibilidad superior, exactitud, y el rendimiento para la identificación de proteínas y péptidos, ha sido una herramienta poderosa para los estudios proteómicos globales ^5,6. Sin embargo, las proteínas de superficie plantean importantes desafíos a la proteómica basadas en MS, comoexisten la mayoría de las proteínas de la superficie en cantidades bajas y con modificaciones pesados. Las regiones que abarcan la membrana de las proteínas de la superficie hacerlos hidrófobo; esto es especialmente el caso para las proteínas transmembrana multipaso. Es por lo tanto difícil de disolver proteínas de membrana en soluciones acuosas sin la ayuda de un detergente; sin embargo, el uso de detergentes generalmente suprime el rendimiento de HPLC y MS ^1,7,8 en la identificación de proteínas. Por lo tanto, las proteínas de membrana han sido mal caracterizada proteómica directas basadas LC-MS.

La glicosilación es una de las modificaciones post-traduccionales más importantes y abundantes que tienen lugar en las proteínas de la superficie celular ^9. La enorme complejidad y heterogeneidad de los glicanos obstaculizan MS señal de péptidos ^"10. Sin embargo, varios métodos proteómicos han utilizado esta modificación única para enriquecer las proteínas de superficie y para eliminar los restos de azúcar a partir de proteínas antes del análisis LC-MS. Estos métodos incluyen a base de la lectina de afinidad de captura ¹¹ y captura química a base de ácido bórico o basado-hidrazida ^12, así como las separaciones de cromatografía hidrófilos ^8,13. La eliminación de los glicanos transforma proteínas de la membrana a las proteínas regulares y simplifica drásticamente la caracterización MS. Debido a que la glicosilación tiene lugar también en las proteínas secretadas que tienen alta solubilidad en contraste con proteínas de la membrana, muchos métodos glycoproteomic están optimizados para proteínas solubles, y tienden a tener menor selectividad glicopéptido y la sensibilidad cuando se realiza el despliegue proteínas de membrana ^8,14. Otros métodos también existen para enriquecer, en particular, las proteínas de la superficie celular, tales como los que utilizan ultracentrifugación ¹⁵ y estrategias de etiquetado ^16. Una comparación detallada entre nuestro método y otros métodos existentes para la caracterización de proteínas de la membrana se llevó a cabo recientemente ^17, y los resultados indicaron que nuestro método puede llevar a cabo igualmente bien, si no semejor, que todos los métodos de proteómica membrana en comparación, pero con una mayor simplicidad.

Para ayudar a los investigadores utilizan este método, detallamos aquí un protocolo general. Este método integra varias ventajas de las estrategias de glycoproteomics existentes y se diseñó específicamente para glicoproteínas de membrana, sin embargo, el método funciona igual de bien para las proteínas secretadas. Las características de este método incluyen: 1) una completa solubilización de proteínas de membrana, 2) un enriquecimiento de glicopéptidos en lugar de glicoproteínas para eliminar el impedimento estérico potencial cuando se utiliza un sustrato sólido de captura, 3) el uso de la química hidrazida para formar enlaces covalentes entre glicopéptidos y el sustrato de captura, de tal manera que los glicopéptidos unidos pueden tolerar lavados rigurosos para alta glycoselectivity, y 4) la capacidad para llevar a cabo todo el procedimiento de captura en un tubo para reducir la pérdida de muestra y se acorta la duración del procedimiento. Después de la aplicación de este método para el estudio de una variabledad de muestras biológicas incluyendo las células y los tejidos, se observó una alta selectividad (> 90%) a las glicoproteínas ^8,17,18.

Protocol

1. Cosecha Membranas Añadir tampón hipotónico (Tris-HCl 10 mM, KCl 10, 1,5 mM de MgCl 2, pH 8,0) con un cóctel inhibidor de la proteasa en un sedimento de células (~ 10 8 células) y se incuba durante 15-30 min en hielo. Lisar las células haciendo pasar la muestra a través de agujas de jeringa (5-10 pasadas) o la homogeneización de la muestra por un homogeneizador Dounce (15-30 golpes). Utilice un hemocitómetro y tinción con azul de tripano para comprobar la eficiencia de la li…

Representative Results

Un diagrama de flujo representativo del procedimiento experimental se resume en la figura 1. El etiquetado y otras etapas de fraccionamiento son opcionales y detalles se describen en una publicación reciente 18. Otra opción es analizar los péptidos no modificados, que no reaccionan con la resina. Las ventajas de análisis de los péptidos no modificados incluyen el potencial de identificación de péptidos y proteínas no glicosiladas, tales como claudinas en uniones estrechas; Una ventaja…

Discussion

Aquí presentamos una estrategia glucopéptidos captura para perfilar las proteínas de la superficie celular. El método se puede aplicar para estudiar las proteínas secretadas, tales como los de la sangre, así como en otros fluidos corporales o en medios de cultivo celular.

El éxito del método se basa en la digestión completa de las muestras; por lo tanto, una caracterización de SDS-PAGE de la eficiencia de la digestión es necesario, especialmente para el análisis por primera vez d…

Materials

DTT	Sigma	646563
TCEP	Sigma	646547
Iodoacetamide	Sigma	A3221
Rapigest SF	Waters	186001860
Sodium periodate	Sigma	311448
PNGase F	New England Biolabs	P0704S
Affi-Gel Hz Hydrazide gel	Bio-Rad	153-6047
Trypsin	Worthington Biomedical	LS02115
Sep-Pak C-18 cartridge	Waters	WAT054955
Oasis MCX cartridge	Waters	186000252
Protease inhibitor coctail	Sigma	P8340
Urea	Amersco	568
Sodium sulphite	Caledon	8360-1
Invertase	Sigma	I0408
Alpha-1 trypsin	Sigma	F2006
Ribonulease B	Sigma	R7884
Avidin	Sigma	A9275
Ovalbumin	Sigma	A5503
Conalbumin	Sigma	C0755