Гликопептиды Захват для клеточной поверхности протеомики
Summary
Белки клеточной поверхности являются биологически важной и широко гликозилированный. Введем здесь подход гликопептид захвата для растворения, обогатить и deglycosylate эти белки для легковесных протеомных анализа на основе ЖХ-МС.
Abstract
Белки клеточной поверхности, в том числе белков внеклеточного матрикса, участвовать во всех крупных клеточных процессов и функций, таких как рост, дифференцировку и пролиферацию. Комплексный характеристика этих белков обеспечивает богатую информацию для поиска биомаркеров, идентификации камерного типа, и выбор лекарственной целевой, а также помогая продвинуть наше понимание клеточной биологии и физиологии. Поверхностные белки, однако, создают значительные аналитические проблемы, из-за их изначально низкой численности, высокой гидрофобностью и тяжелых пост-трансляционных модификаций. Воспользовавшись тем, что распространенной гликозилирования на поверхностных белков, введем здесь высокой пропускной подход гликопептид захвата, которая объединяет в себе преимущества нескольких существующих N-glycoproteomics средств. Наш метод может обогатить гликопептиды, полученные из поверхностных белков и удалить их гликаны для легковесных протеомики с использованием ЖХ-МС. Разрешенный N-glycoproteome включает инфormation идентичности белка и количества, а также их сайтов гликозилирования. Этот метод был применен к серии исследований в областях, в том числе рака, стволовых клеток и токсичности препаратов. Ограничение метода заключается в низкой численности поверхностных мембранных белков, таких, что относительно большое количество образцов, необходимых для проведения такого анализа по сравнению с исследований сосредоточены на цитозольными белков.
Introduction
Белки клеточной поверхности взаимодействуют с внеклеточной среде и передают сигналы с внешней стороны к внутренней части клетки. Таким образом, эти белки, в том числе белков внеклеточного матрикса, играют важную роль во всех аспектах клеточной биологии и физиологии, начиная от распространения, роста миграции, дифференциации к старению и так далее. Поверхностные белки функционируют за счет взаимодействия с другими клетками, белков и малых молекул 1-3. Молекулярная характеристика белков клеточной поверхности представляет большой интерес не только для биологов, но и для фармацевтических компаний, так как более 60% лекарственных средств направлены на клеточной поверхности белков 4.
Тандемной масс-спектрометрии (МС), с превосходной чувствительностью, точностью и пропускной способности для идентификации белков и пептидов, был мощным инструментом для глобальных протеомных исследований 5,6. Тем не менее, поверхностные белки создают значительные проблемы для протеомики MS-основе, каксуществует большинство поверхностные белки в небольших количествах и с тяжелыми изменениями. Мембранные охватывающей регионы поверхностных белков сделать их гидрофобными; это особенно касается многопроходных белков трансмембранных. Таким образом, трудно растворим мембранных белков в водных растворах без помощи моющего средства; Однако использование моющих средств обычно подавляет производительность ВЭЖХ и МС 1,7,8 в идентификации белков. Таким образом, мембранные белки были слабо отличающийся тем, прямых протеомики на основе LC-MS.
Гликозилирование является одним из наиболее важных и распространенных пост-трансляционных модификаций, происходящих в белков клеточной поверхности 9. Огромный сложность и неоднородность гликанах препятствовать MS сигнальных пептидов '10. Тем не менее, несколько протеомические методы использовали эту уникальную модификацию обогатить поверхностные белки и удалить остатки сахара из белков до ЖХ-МС анализа. Это методс включить лектина на основе сродства захвата 11 и гидразида на основе борной кислоты или на основе химического захвата 12, а также гидрофильные хроматографии разделения 8,13. Удаление гликанах превращает мембранные белки с обычными белками и резко упрощает MS характеристику. Потому гликозилирования также происходит в секретируемых белков, которые имеют высокую растворимость в отличие от мембранных белков, многие glycoproteomic методы оптимизированы для растворимых белков, и, как правило, имеют более низкий гликопептидам селективности и чувствительности, когда развертывается с мембранными белками 8,14. Другие методы также существуют для обогащения, в частности, белков клеточной поверхности, такие как те, которые используют ультрацентрифугирования 15 и маркировка стратегии 16. Подробное сравнение между нашего метода и других существующих методов для характеристики мембранных белков проводили в последнее 17, и результаты показали, что наш метод может функционировать одинаково хорошо, если нелучше, чем все сравниваемых методов мембранные протеомики, но с более высокой простоты.
Чтобы помочь исследователям использовать этот метод, мы здесь подробно общий протокол. Этот метод объединяет несколько преимуществ существующих glycoproteomics стратегий и разработали специально для мембранных гликопротеинов, но метод работает одинаково хорошо для секретируемых белков. Характеристики этого метода включают: 1) полное солюбилизации мембранных белков, 2) обогащение гликопептидов вместо гликопротеинов Для устранения возможности пространственное затруднение при использовании твердого захваченной подложку, 3) использование гидразида химии с образованием ковалентных связей между гликопептиды и захвата подложки, таким образом, что соединенные гликопептиды могут переносить жесткие моет для высокого glycoselectivity и 4) способность проводить всю процедуру захвата в одну трубку для снижения потерь образца и продолжительности укороченной процедуры. После реализации этого метода к изучению с переменнымщества биологических образцов, включая клетки и ткани, мы наблюдали высокую селективность (> 90%), чтобы гликопротеинов 8,17,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы вводим стратегию гликопептид-захвата для профилирования белков клеточной поверхности. Этот метод может быть применен для изучения секретируемые белки, такие как те в крови, а также в других жидкостей организма или в культуральной среде клеток.
Успех метода зав…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано запуска фонда Университета Саймона Фрейзера.
Materials
| DTT | Sigma | 646563 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Iodoacetamide | Sigma | A3221 | |
| Rapigest SF | Waters | 186001860 | |
| Sodium periodate | Sigma | 311448 | |
| PNGase F | New England Biolabs | P0704S | |
| Affi-Gel Hz Hydrazide gel | Bio-Rad | 153-6047 | |
| Trypsin | Worthington Biomedical | LS02115 | |
| Sep-Pak C-18 cartridge | Waters | WAT054955 | |
| Oasis MCX cartridge | Waters | 186000252 | |
| Protease inhibitor coctail | Sigma | P8340 | |
| Urea | Amersco | 568 | |
| Sodium sulphite | Caledon | 8360-1 | |
| Invertase | Sigma | I0408 | |
| Alpha-1 trypsin | Sigma | F2006 | |
| Ribonulease B | Sigma | R7884 | |
| Avidin | Sigma | A9275 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Conalbumin | Sigma | C0755 |
References
- Cho, W., Stahelin, R. V. Membrane-protein interactions in cell signaling and membrane trafficking. Annual review of biophysics and biomolecular structure. 34, 119-151 (2005).
- Tadevosyan, A., Vaniotis, G., Allen, B. G., Hebert, T. E., Nattel, S. G. protein-coupled receptor signalling in the cardiac nuclear membrane: evidence and possible roles in physiological and pathophysiological function. The Journal of physiology. 590, 1313-1330 (2012).
- White, S. H. Biophysical dissection of membrane proteins. Nature. 459, 344-346 (2009).
- Heijne, G. Membrane-protein topology. . Nature reviews Molecular cell biology. 7, 909-918 (2006).
- Cox, J., Mann, M. Quantitative high-resolution proteomics for data-driven systems biology. Annual review of biochemistry. 80, 273-299 (2011).
- Lamond, A. I., et al. Advancing cell biology through proteomics in space and time (PROSPECTS). Mol Cell Proteomics. 11, (2012).
- Savas, J. N., Stein, B. D., Wu, C. C., Yates 3rd, J. R. Mass spectrometry accelerates membrane protein analysis. Trends in biochemical sciences. 36, 388-396 (2011).
- Sun, B., et al. Shotgun glycopeptide capture approach coupled with mass spectrometry for comprehensive glycoproteomics. Mol Cell Proteomics. 6, 141-149 (2007).
- Lowe, J. B. Glycosylation, immunity, and autoimmunity. Cell. 104, 809-812 (2001).
- Dodds, E. D. Gas-phase dissociation of glycosylated peptide ions. Mass spectrometry reviews. 31, 666-682 (2012).
- Kaji, H., et al. Lectin affinity capture, isotope-coded tagging and mass spectrometry to identify N-linked glycoproteins. Nat Biotechnol. 21, 667-672 (2003).
- Zhang, H., Li, X. J., Martin, D. B., Aebersold, R. Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry. Nat Biotechnol. 21, 660-666 (2003).
- Hagglund, P., Bunkenborg, J., Elortza, F., Jensen, O. N., Roepstorff, P. A new strategy for identification of N-glycosylated proteins and unambiguous assignment of their glycosylation sites using HILIC enrichment and partial deglycosylation. J Proteome Res. 3, 556-566 (2004).
- Bond, M. R., Kohler, J. J. Chemical methods for glycoprotein discovery. Current opinion in chemical biology. 11, 52-58 (2007).
- Pasini, E. M., et al. In-depth analysis of the membrane and cytosolic proteome of red blood cells. Blood. 108, 791-801 (2006).
- Wollscheid, B., et al. Mass-spectrometric identification and relative quantification of N-linked cell surface glycoproteins. Nat Biotechnol. 27, 378-386 (2009).
- Sun, B., et al. N-Glycoproteome of E14.Tg2a mouse embryonic stem cells. PLoS ONE. 8, (2013).
- Sun, B., et al. Glycocapture-assisted global quantitative proteomics (gagQP) reveals multiorgan responses in serum toxicoproteome. J Proteome Res. 12, 2034-2044 (2013).
