Hücre Yüzey Proteomics için glikopeptiddir Yakalama
Summary
Hücre yüzey proteinleri biyolojik olarak önemli ve yaygın olarak glikosile bulunmaktadır. Biz kolay LC-MS tabanlı Proteomik analizler için bu proteinleri, çözünür hale zenginleştirmek ve deglycosylate burada bir glikopeptid-yakalama yaklaşımını tanıtmak.
Abstract
Hücre-dışı matris proteinleri de dahil olmak üzere hücre yüzeyi proteinleri, örneğin büyümesi, farklılaşması ve proliferasyonu gibi tüm önemli hücresel süreçleri ve fonksiyonlar, katılabilir. Bu proteinlerin kapsamlı bir karakterizasyonu biomarker keşif, hücre tipi belirlenmesi ve ilaç-hedef seçimi yanı sıra, hücre biyolojisi ve fizyolojisi anlayışımızı ilerletmek için yardımcı olmak için zengin bilgi sağlar. Yüzey proteinleri Ancak nedeniyle doğal olarak düşük yoğunlukta, yüksek hidrofobik ve ağır post-translasyonel modifikasyonlar, önemli analitik zorluklar oluşturmaktadır. Yüzey proteinleri üzerinde yaygın glikolizasyon yararlanarak, biz burada birkaç mevcut N-Glycoproteomics araçlarının avantajlarını entegre bir yüksek verimli glikopeptit yakalama yaklaşımını tanıtmak. Bizim yöntem yüzey proteinleri elde glıkopeptıtlerı zenginleştirmek ve LC-MS kullanılarak uyduruk Proteomikte için kendi glikanları kaldırabilirsiniz. Çözülmüş N-glycoproteome inf içerirprotein kimlik ve miktarı gibi glycoslasyonun sitelerinin ormation. Bu yöntem, kanser, kök hücreler ve ilaç zehirlenmesi gibi alanlarda bir dizi çalışma uygulanmıştır. Bu yöntemin örnekleri sınırlama nispeten büyük bir miktarı, sitosolik proteinler merkezli çalışmalara göre bu analiz için gerekli olan şekilde, bir yüzey zar proteinleri, en düşük yoğunlukta yer alır.
Introduction
Hücre yüzey proteinleri, hücre dışı çevre ile etkileşim ve bir hücrenin içine dışarıdan gelen sinyalleri iletir. Bu nedenle, hücre dışı matris proteinleri de dahil olmak üzere, bu proteinler, hücre biyolojisi ve çoğalma, büyüme, göç, farklılaşmadan benzeri yaşlanma ve fizyoloji kadar tüm yönleriyle kritik roller oynar. Yüzey proteinleri diğer hücrelerin, proteinler ve küçük moleküller 1-3 etkileşerek çalışır. Ilaçların fazla% 60 hücre yüzeyi proteinleri 4 hedeflenir gibi hücre yüzeyi proteinlerinin moleküler karakterizasyonu, biyologlar için değil, aynı zamanda farmasötik şirketler için sadece büyük bir ilgi çekmektedir.
Üstün duyarlılık, ve protein ve peptitlerin tanımlanması için verim ile tandem kütle spektrometrisi (MS), küresel, proteomik 5,6 çalışmalar için güçlü bir araç olmuştur. Oysa, yüzey proteinleri gibi, MS tabanlı Proteomikte için önemli sorunlar teşkilÇoğu yüzey proteinleri düşük miktarlarda ve ağır değişiklikler ile mevcut. Yüzey proteinleri membran-yayılan bölgeleri bunları hidrofobik hale getirmek; Bu, özellikle çok pasolu zar proteinleri için geçerlidir. Bir deterjan yardımı olmadan, sulu çözeltiler içinde zar proteinleri çözmek için olan, böylece zordur; Bununla birlikte deterjanların kullanımı genellikle protein tanımlama HPLC ve MS 1,7,8 performansını engeller. Bu nedenle, membran proteinleri zayıf doğrudan LC-MS tabanlı proteomik karakterize edilmiştir.
Glikozilasyon hücre yüzey proteinleri 9 içinde yer alan en önemli ve bol post-translasyonel modifikasyonlar biridir. Glikanların muazzam karmaşıklığı ve heterojenite peptidin MS sinyali 10 engelleyebilir. Bununla birlikte, pek çok yöntem proteomik yüzey proteinlerini zenginleştirmek ve önceki LC-MS analizi için proteinlerden şeker bölümlerine kaldırmak için bu tek değişiklik kullandık. Bu yöntems lektin bazlı afinite yakalama 11 ve hidrazid bazlı ya da borik asit bazlı kimyasal yakalama 12 hem de hidrofilik kromatografisi ayrımı 8,13 içerir. Glikanların kaldırılması normal proteinlere dönüştüren zar proteinleri ve büyük ölçüde MS karakterizasyonu kolaylaştırır. Glikosilasyon da zar proteinleri aksine, yüksek çözünürlüğe sahip olan salgılanmış proteinler yer alır, çünkü birçok glycoproteomic yöntem çözünür proteinler için optimize edilmiş, ve daha düşük seçicilik ve glikopeptid proteinleri 8,14 zar konuşlandırılmış olan duyarlılığı sahip olma eğilimi vardır. Başka yöntemler de ettirecek vardır, özellikle de, bu tür ultrasantrifüjleme 15 ve markalama stratejileri 16 kullananlar gibi hücre yüzeyi proteinleri. Membran proteinleri karakterize bizim yöntem ve diğer mevcut yöntemler arasında ayrıntılı bir karşılaştırma son zamanlarda 17 yürütülen ve sonuçları bizim yöntem eşit derecede iyi gerçekleştirebilirsiniz belirtti, eğer değildiTüm karşılaştırıldığında membran proteomiks yöntemlere göre daha iyi, ancak daha yüksek sadeliği ile.
Araştırmacılar bu yöntemi kullanmak yardımcı olmak için, burada detay genel bir protokol. Bu yöntem, mevcut Glycoproteomics stratejileri çeşitli avantajları entegre ve zar glikoproteinlerinin için özel olarak tasarlanmış olan, ancak yöntem salgılanan proteinler için de aynı derecede iyi çalışır. Bu yöntemin özellikleri şunlardır: 1) zar proteinlerinin tam bir çözünmesi, 2) kullanılarak bir katı madde yakalama alt katmanını kullanırken, potansiyel sterik engellemeyi ortadan kaldırmak için glikoproteinlerin glıkopeptıtlerın bir zenginleştirme, 3) hidrazid kimyası kullanımı ile kovalent bağlar oluşturmak için glikopeptidler ve yakalama alt-tabaka, bağlı glikopeptitler yüksek glycoselectivity için sıkı yıkama tolere edebilir, ve 4) yeteneği azalır örnek kaybı ve daha kısa işlem süresi için, bir tüp içinde tüm yakalama işlemi yapmak için bu gibi. Bir değişken okuyan için bu yöntemi uyguladıktan sonrahücreler ve dokular dahil olmak üzere, biyolojik örneklerin ety biz glikoproteinler 8,17,18 için yüksek seçicilik (> 90%) gözlenmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada hücre yüzey proteinleri profil için bir glikopeptid-yakalama stratejisini tanıtmak. Yöntem, bu tür salgılanmış kan gibi proteinler, yanı sıra diğer vücut sıvılarında veya hücre kültür ortamı içinde incelemek için uygulanabilir.
Yöntemin başarısı numunelerin tam sindirim dayanır; bu nedenle, sindirim bir verimlilik SDS-PAGE karakterizasyonu, özellikle numunenin ilk kez analizi için, gereklidir. Tam bir sindirim zar proteinleri için zor olabilir ve sadece m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma Simon Fraser Üniversitesi başlangıç fonu tarafından desteklenmiştir.
Materials
| DTT | Sigma | 646563 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Iodoacetamide | Sigma | A3221 | |
| Rapigest SF | Waters | 186001860 | |
| Sodium periodate | Sigma | 311448 | |
| PNGase F | New England Biolabs | P0704S | |
| Affi-Gel Hz Hydrazide gel | Bio-Rad | 153-6047 | |
| Trypsin | Worthington Biomedical | LS02115 | |
| Sep-Pak C-18 cartridge | Waters | WAT054955 | |
| Oasis MCX cartridge | Waters | 186000252 | |
| Protease inhibitor coctail | Sigma | P8340 | |
| Urea | Amersco | 568 | |
| Sodium sulphite | Caledon | 8360-1 | |
| Invertase | Sigma | I0408 | |
| Alpha-1 trypsin | Sigma | F2006 | |
| Ribonulease B | Sigma | R7884 | |
| Avidin | Sigma | A9275 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Conalbumin | Sigma | C0755 |
References
- Cho, W., Stahelin, R. V. Membrane-protein interactions in cell signaling and membrane trafficking. Annual review of biophysics and biomolecular structure. 34, 119-151 (2005).
- Tadevosyan, A., Vaniotis, G., Allen, B. G., Hebert, T. E., Nattel, S. G. protein-coupled receptor signalling in the cardiac nuclear membrane: evidence and possible roles in physiological and pathophysiological function. The Journal of physiology. 590, 1313-1330 (2012).
- White, S. H. Biophysical dissection of membrane proteins. Nature. 459, 344-346 (2009).
- Heijne, G. Membrane-protein topology. . Nature reviews Molecular cell biology. 7, 909-918 (2006).
- Cox, J., Mann, M. Quantitative high-resolution proteomics for data-driven systems biology. Annual review of biochemistry. 80, 273-299 (2011).
- Lamond, A. I., et al. Advancing cell biology through proteomics in space and time (PROSPECTS). Mol Cell Proteomics. 11, (2012).
- Savas, J. N., Stein, B. D., Wu, C. C., Yates 3rd, J. R. Mass spectrometry accelerates membrane protein analysis. Trends in biochemical sciences. 36, 388-396 (2011).
- Sun, B., et al. Shotgun glycopeptide capture approach coupled with mass spectrometry for comprehensive glycoproteomics. Mol Cell Proteomics. 6, 141-149 (2007).
- Lowe, J. B. Glycosylation, immunity, and autoimmunity. Cell. 104, 809-812 (2001).
- Dodds, E. D. Gas-phase dissociation of glycosylated peptide ions. Mass spectrometry reviews. 31, 666-682 (2012).
- Kaji, H., et al. Lectin affinity capture, isotope-coded tagging and mass spectrometry to identify N-linked glycoproteins. Nat Biotechnol. 21, 667-672 (2003).
- Zhang, H., Li, X. J., Martin, D. B., Aebersold, R. Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry. Nat Biotechnol. 21, 660-666 (2003).
- Hagglund, P., Bunkenborg, J., Elortza, F., Jensen, O. N., Roepstorff, P. A new strategy for identification of N-glycosylated proteins and unambiguous assignment of their glycosylation sites using HILIC enrichment and partial deglycosylation. J Proteome Res. 3, 556-566 (2004).
- Bond, M. R., Kohler, J. J. Chemical methods for glycoprotein discovery. Current opinion in chemical biology. 11, 52-58 (2007).
- Pasini, E. M., et al. In-depth analysis of the membrane and cytosolic proteome of red blood cells. Blood. 108, 791-801 (2006).
- Wollscheid, B., et al. Mass-spectrometric identification and relative quantification of N-linked cell surface glycoproteins. Nat Biotechnol. 27, 378-386 (2009).
- Sun, B., et al. N-Glycoproteome of E14.Tg2a mouse embryonic stem cells. PLoS ONE. 8, (2013).
- Sun, B., et al. Glycocapture-assisted global quantitative proteomics (gagQP) reveals multiorgan responses in serum toxicoproteome. J Proteome Res. 12, 2034-2044 (2013).
