Glycopeptid-Capture für Zelloberflächen Proteomics

Summary

Zelloberflächen-Proteine ​​sind biologisch wichtige und weithin glykosyliert. Wir stellen hier eine Glykopeptid-Capture-Ansatz für einfache LC-MS basierte Proteomanalysen löslich zu machen, zu bereichern, und deglycosylieren diese Proteine.

Abstract

Zelloberflächenproteine, einschließlich extrazellulären Matrixproteinen, sich an allen wichtigen zellulären Prozessen und Funktionen, wie Wachstum, Differenzierung und Proliferation. Eine umfassende Charakterisierung dieser Proteine ​​bietet reichhaltige Informationen zur Entdeckung von Biomarkern, Zelltyp-Identifikation und Drogenzielauswahl, als auch helfen, unser Verständnis der Zellbiologie und Physiologie voraus. Oberflächenproteine ​​stellen jedoch erhebliche analytische Herausforderungen, die aufgrund ihrer inhärent niedrigen Fluss, hohe Hydrophobie und schwere post-translationale Modifikationen. Unter Ausnutzung der vorherrschenden Glykosylierung auf Oberflächenproteine, führen wir hier ein Hochdurchsatz-Glycopeptid-Capture-Ansatz, der die Vorteile von mehreren vorhandenen N-Glycoproteomikstrategie Mittel integriert. Unsere Methode kann die Glykopeptide von Oberflächenproteinen abgeleitet bereichern und entfernen ihre Glykane für einfache Proteomik mittels LC-MS. Die beschlossene N-glycoproteome umfasst die informationen von Protein Identität und Quantität sowie ihre Websites der Glykosylierung. Dieses Verfahren hat zu einer Reihe von Studien in Bereichen wie Krebs, Stammzellen und Arzneimitteltoxizität angewendet. Die Beschränkung des Verfahrens liegt in der geringen Häufigkeit von Oberflächenmembranproteinen, so dass eine relativ große Menge von Proben für die Analyse erforderlich im Vergleich zu Studien am cytosolischen Proteine ​​zentriert.

Introduction

Zelloberflächen-Proteine ​​interagieren mit der extrazellulären Umgebung und leiten Signale von der Außenseite zur Innenseite der Zelle. Somit sind diese Proteine, einschließlich extrazellulären Matrixproteinen, spielen wichtige Rollen in allen Aspekten der Zellbiologie und der Physiologie von Proliferation, Wachstum, Migration, Differenzierung Alterung und so weiter. Oberflächenproteine ​​funktionieren durch die Interaktion mit anderen Zellen, Proteinen und kleinen Molekülen ^03.01. Molekulare Charakterisierung von Zelloberflächenproteinen ist von großem Interesse, nicht nur für Biologen, sondern auch für die pharmazeutische Industrie, da mehr als 60% der Medikamente, Zelloberflächenproteine ^​​4 ausgerichtet.

Tandem-Massenspektrometrie (MS), mit seiner überlegenen Sensitivität, Genauigkeit und Durchsatz für die Identifizierung von Proteinen und Peptiden, wurde ein leistungsfähiges Werkzeug für die globale proteomische Studien ^5,6. Doch stellen Oberflächenproteine ​​erhebliche Herausforderungen zu MS-basierte Proteomik, wiedie meisten Oberflächenproteine ​​gibt es in geringen Mengen und mit schweren Veränderungen. Die Membran-überspannenden Regionen der Oberflächenproteine ​​machen sie hydrophob ist; Dies ist insbesondere der Fall bei Multitransmembranproteine. Es ist daher schwierig, Membranproteine ​​in wässrigen Lösungen ohne Zuhilfenahme eines Detergens zu lösen; Jedoch ist die Verwendung von Waschmitteln in der Regel unterdrückt die Leistung der HPLC und MS ^1,7,8 Proteinidentifikation. Daher Membranproteine ​​wurden schlecht in direkten LC-MS basierte Proteomik gekennzeichnet.

Die Glykosylierung ist eine der wichtigsten und reichlich post-translationale Modifikationen, die sich in Zelloberflächenproteine ^​​9. Die enorme Komplexität und Heterogenität der Glykane behindern Peptide 'MS-Signal ^10. Dennoch haben mehrere proteomische Methoden dieses einzigartige Modifikation verwendet werden, um Oberflächenproteine ​​zu bereichern und die Zuckerreste von Proteinen vor der LC-MS-Analyse zu entfernen. Diese Methodes sind Lektin-basierte Affinitätseinfang ¹¹ und Hydrazid-basierten oder Borsäure Chemie Capture ¹² sowie hydrophile Trennungen ^8,13. Die Entfernung der Glykane verwandelt Membranproteine, regelmäßige Proteine ​​und vereinfacht die MS Charakterisierung drastisch. Da Glykosylierung in sezernierte Proteine, die eine hohe Löslichkeit im Gegensatz zu Membranproteine ​​erfolgt auch, viele glycoproteomische Methoden für lösliche Proteine ​​optimiert und tendenziell niedrigere Glycopeptid Selektivität und Empfindlichkeit, wenn sie eingesetzt werden, um Proteine ^​​8,14 Membran haben. Andere Verfahren bestehen auch zu bereichern, insbesondere Zelloberflächenproteine, wie z. B. jene, die Ultrazentrifugation ¹⁵ und Markierungsstrategien ^16. Ein detaillierter Vergleich zwischen unserem Verfahren und anderen bestehenden Methoden zur Charakterisierung von Membranproteinen durchgeführt wurde kürzlich ^17, und die Ergebnisse zeigten, daß unser Verfahren ebenso gut ausführen kann, wenn nichtbesser, als alle gegen Membran Proteomics Methoden, aber mit höheren Einfachheit.

Um Forscher mit dieser Methode, die wir hier ausführlich ein allgemeines Protokoll. Diese Methode integriert mehrere Vorteile der bestehenden Glycoproteomikstrategie Strategien und ist speziell für Membran-Glykoproteine ​​entwickelt, doch die Methode funktioniert genauso gut für sekretierte Proteine. Die Merkmale dieses Verfahrens sind: 1) eine vollständige Solubilisierung von Membranproteinen, 2) eine Anreicherung von Glycopeptiden anstelle von Glykoproteinen, die potentielle sterische Behinderung zu vermeiden, wenn unter Verwendung eines festen Erfassungs Substrat, 3) die Verwendung von Hydrazid-Chemie, um kovalente Bindungen zwischen Form Glycopeptide und die Erfassung Substrat, so dass das gebundene Glycopeptide können stringente Waschungen für Hoch glycoselectivity tolerieren, und 4) die Fähigkeit, die gesamte Aufnahmevorgang in einem Rohr zur Probenverlust reduziert und verkürzt die Dauer Verfahren durchzuführen. Nach Durchführung dieses Verfahrens, um das Studium eine variableety von biologischen Proben, einschließlich Zellen und Geweben beobachteten wir eine hohe Selektivität (> 90%) an Glycoproteine ^{​​8,17,18.}

Protocol

Ein. Ernte-Membranen Hinzufügen hypotonischen Puffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, pH 8,0) mit Proteaseinhibitorcocktail auf einen Zellpellet (~ 10 8 Zellen) und Inkubation für 15-30 min auf Eis. Lyse der Zellen, indem die Probe durch Spritzennadeln (5-10 Durchläufe) oder Homogenisieren der Probe von einem Dounce Homogenisator (15-30 Schläge). Verwenden Sie eine Zählkammer und Trypanblaufärbung um die Effizienz der Lyse zu überprüfen. Erhalten Sie die mikro…

Representative Results

Ein repräsentatives Flussdiagramm des experimentellen Verfahrens ist in Fig. 1 zusammengefaßt. Die Etikettierung und weitere Fraktionierung Schritte sind optional und Details sind in einer Veröffentlichung 18 beschrieben. Eine weitere Möglichkeit ist die unveränderten Peptide, die nicht mit dem Harz reagieren zu analysieren. Die Vorteile des Analysierens der unmodifizierten Peptide umfassen die Identifizierung von potentiellen nicht-glykosylierte Peptide und Proteine, wie Claudinen in ti…

Discussion

Hier stellen wir ein Glycopeptid-Capture-Strategie zur Profilierung Zelloberflächenproteine. Das Verfahren kann angewendet werden, um sekretierte Proteine, wie sie in Blut, wie auch in anderen Körperflüssigkeiten oder Zellkulturmedien zu studieren.

Der Erfolg des Verfahrens beruht auf der vollständigen Verdau von Proben; Daher ist ein SDS-PAGE-Charakterisierung der Effizienz der Verdauung notwendig, insbesondere für die erste Zeitanalyse einer Probe. Eine vollständige Verdauung kann ei…

Materials

DTT	Sigma	646563
TCEP	Sigma	646547
Iodoacetamide	Sigma	A3221
Rapigest SF	Waters	186001860
Sodium periodate	Sigma	311448
PNGase F	New England Biolabs	P0704S
Affi-Gel Hz Hydrazide gel	Bio-Rad	153-6047
Trypsin	Worthington Biomedical	LS02115
Sep-Pak C-18 cartridge	Waters	WAT054955
Oasis MCX cartridge	Waters	186000252
Protease inhibitor coctail	Sigma	P8340
Urea	Amersco	568
Sodium sulphite	Caledon	8360-1
Invertase	Sigma	I0408
Alpha-1 trypsin	Sigma	F2006
Ribonulease B	Sigma	R7884
Avidin	Sigma	A9275
Ovalbumin	Sigma	A5503
Conalbumin	Sigma	C0755