세포 표면 단백질 체학 (Proteomics)에 대한 글리코 펩타이드 캡처
Summary
세포 표면 단백질은 생물학적으로 중요하고 광범위 글리코 실화이다. 우리는 손쉬운 LC-MS 기반 단백체 분석을 위해이 단백질을 용해 풍부하고 deglycosylate 여기 글리코 펩타이드 캡처 방법을 소개합니다.
Abstract
세포 외 기질 단백질을 포함한 세포 표면 단백질은, 이러한 성장, 분화, 증식 등의 모든 주요 셀룰러 프로세스 및 기능에 참여합니다. 이 단백질의 포괄적 인 특성은 바이오 마커 발견, 세포 유형 식별 및 약물 표적 선택뿐만 아니라, 세포 생물학 및 생리학에 대한 우리의 이해를 사전에 도움 풍부한 정보를 제공합니다. 표면 단백질은, 그러나, 그들의 본질적으로 낮은 풍부, 소수성, 무거운 번역 후 변형의 중요한 분석 과제를 포즈. 표면 단백질에 널리 당화을 활용, 우리는 여기에 몇 가지 기존의 N-glycoproteomics 수단의 장점을 통합하는 높은 처리량 글리코 펩타이드 캡처 방법을 소개합니다. 우리의 방법은 표면 단백질에서 파생 된 글리코 펩타이드를 풍부하게하고 LC-MS를 사용하여 손쉬운 프로테오믹스에 대한 자신의 글리 칸을 제거 할 수 있습니다. 확인 된 N-glycoproteome는 INF를 포함한다단백질의 정체성과 양뿐만 아니라 포도당의 자신의 사이트의 ormation. 이 방법은 암, 줄기 세포, 약물 독성을 포함한 영역에서 일련의 연구에 적용되어왔다. 방법의 한계는 샘플의 상대적으로 많은 양의 세포질 단백질을 중심으로 연구와 비교하여 본 분석에 필요한되도록 표면 막 단백질의 낮은 풍부에있다.
Introduction
세포 표면 단백질은 세포 외 환경과 상호 작용하는 세포의 외부에서 내부로의 신호를 중계. 따라서, 세포 외 기질 단백질을 포함하여 이러한 단백질은 세포 생물학 및 증식, 성장, 이동, 분화에서 등 노화에 이르기까지 생리학의 모든 측면에서 중요한 역할을한다. 표면 단백질이 다른 세포, 단백질과 작은 분자 1-3와 상호 작용에 의해 작동합니다. 약물의 60 % 이상이 세포 표면 단백질 4를 대상으로하는 등 세포 표면 단백질의 분자 특성은 생물 학자뿐만 아니라, 제약 회사를위한뿐만 아니라 큰 관심입니다.
뛰어난 감도, 정확성 및 단백질과 펩티드의 식별을위한 처리량 텐덤 질량 분석법 (MS)는 글로벌 프로테오믹스 연구 5,6를위한 강력한 도구이다. 그러나, 표면 단백질은, MS-기반 프로테오믹스에 상당한 도전을 제기대부분의 표면 단백질은 낮은 수량과 무거운 수정으로 존재한다. 표면 단백질의 막에 걸친 영역들을 소수성 렌더링; 이것은 특히 다중 경로 막 횡단 단백질에 대한 경우이다. 이 세제의 도움없이 수용액에 막 단백질을 용해하는 것이 곤란하다; 그러나 세제의 사용은 일반적으로 단백질 식별의 HPLC와 MS -1,7,8,8의 성능을 억제한다. 따라서, 막 단백질은 가난 직접 LC-MS 기반 프로테오믹스 특징으로하고 있습니다.
포도당은 세포 표면 단백질 9에서 일어나고있는 가장 중요하고 풍부한 번역 후 변형 중 하나입니다. 글리 칸의 엄청난 복잡성과 이질성은 펩티드 'MS 신호 (10)를 방해. 그럼에도 불구하고, 몇 가지 프로테오믹스 방법은 표면의 단백질을 풍부하게하기 전에 LC-MS 분석에 단백질에서 설탕 부분을 제거하는이 독특한 변형을 사용했다. 이 방법의 렉틴 기반 선호도 캡처 (11)과 하이 드라 지드 기반 또는 붕산 기반 화학 캡처 (12)뿐만 아니라 친수성 크로마토 그래피 분리 8,13 있습니다. 글리 칸의 제거는 일반 단백질에 막 단백질을 변환하고 크게 MS의 특성을 단순화합니다. 당화 또한 단백질 막에 대비 높은 용해도를 분비 단백질에서 발생하기 때문에, 많은 glycoproteomic 방법은 수용성 단백질에 최적화 된 낮은 글리코 펩티드 선택과 단백질 8,14를 막에 배포되는 감도를 갖는 경향이있다. 다른 방법도 풍부하게 존재한다, 특히, 초 원심 분리 (15) 및 라벨 (16) 전략을 사용하는 것과 같은 세포 표면 단백질. 막 단백질의 특성에 대한 우리의 방법과 기존의 방법과 자세한 비교는 최근 17를 실시하고, 그 결과는 우리의 방법이 동일하게 수행 할 수있는 표시, 경우에 없습니다모든 비교 막 단백질 체학 방법보다 더 나은,하지만 더 소박하고.
연구팀은이 방법을 사용하기 위해, 여기에 우리 세부 일반 프로토콜입니다. 이 방법은 기존의 glycoproteomics 전략의 몇 가지 장점을 통합하고 막 당 단백질을 위해 특별히 고안되어, 아직 방법은 분비 단백질을 동일하게 작동합니다. 이 방법의 특징은 1) 막 단백질의 완전한 용해, 2) 대신에 고체 포집 기판을 사용하는 경우 잠재적 인 입체 장해를 제거하는 당 단백질의 글리코 펩타이드의 농축, 3) 하이 드라 지드 화학의 사용은 공유 결합 사이를 형성하도록 글리코 펩타이드와 캡처 기판 접합 글리코 펩타이드가 높은 glycoselectivity 엄격한 세척을 견딜 수 있고, 4) 능력이 감소 샘플 손실 및 단축 절차 기간 동안 하나의 튜브 전체 포착 절차를 수행 할 수 있도록. VARI 연구에이 방법을 실행 한 후세포와 조직 등의 생체 시료 중의 ety, 우리는 당 단백질 8,17,18에 높은 선택성 (> 90 %)을 관찰했다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서 우리는 세포 표면 단백질 프로파일에 대한 글리코 펩타이드 캡처 전략을 소개합니다. 방법은 분비 된 혈액에서와 단백질뿐 아니라 기타 체액 또는 세포 배양 배지에서 연구에 적용될 수있다.
방법의 성공은 샘플의 완전 분해에 의존한다; 따라서 소화 효율의 SDS-PAGE 특성화 특히 시료의 처음 분석을 위해 필요하다. 완전한 소화는 막 단백질에 대한 도전 할 수 있고, ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 사이먼 프레이저 대학의 시작 기금에 의해 지원되었다.
Materials
| DTT | Sigma | 646563 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Iodoacetamide | Sigma | A3221 | |
| Rapigest SF | Waters | 186001860 | |
| Sodium periodate | Sigma | 311448 | |
| PNGase F | New England Biolabs | P0704S | |
| Affi-Gel Hz Hydrazide gel | Bio-Rad | 153-6047 | |
| Trypsin | Worthington Biomedical | LS02115 | |
| Sep-Pak C-18 cartridge | Waters | WAT054955 | |
| Oasis MCX cartridge | Waters | 186000252 | |
| Protease inhibitor coctail | Sigma | P8340 | |
| Urea | Amersco | 568 | |
| Sodium sulphite | Caledon | 8360-1 | |
| Invertase | Sigma | I0408 | |
| Alpha-1 trypsin | Sigma | F2006 | |
| Ribonulease B | Sigma | R7884 | |
| Avidin | Sigma | A9275 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Conalbumin | Sigma | C0755 |
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