Summary
Celleoverfladeproteiner er biologisk vigtige og almindeligt glycosyleret. Vi introducerer her en glycopeptid-capture metode til at opløse, berige og deglycosylate disse proteiner for letkøbte LC-MS baserede proteomikanalyser.
Abstract
Celleoverfladeproteiner, herunder ekstracellulære matrix proteiner, deltage i alle større cellulære processer og funktioner, såsom vækst, differentiering og proliferation. En omfattende karakterisering af disse proteiner giver rig information til biomarkør opdagelse, identifikation celle-typen, og valg af medicin-target, samt hjælpe til at fremme vores forståelse af cellebiologi og fysiologi. Overfladeproteiner dog anledning betydelige analytiske udfordringer på grund af deres iboende lav tæthed, høj hydrofobicitet, og tunge post-translationelle modifikationer. Drage fordel af den fremherskende glykosylering på overfladeproteiner, vi indfører her en high-throughput glycopeptidet-capture tilgang, der integrerer fordelene ved flere eksisterende N-glycoproteomics midler. Vores metode kan berige glycopeptiderne afledt af overfladeproteiner og fjerne deres glycans for letkøbte proteomics ved hjælp af LC-MS. Den løst N-glycoproteome omfatter information protein identitet og mængde samt deres lokaliteter af glycosylering. Denne metode er blevet anvendt på en række undersøgelser i områder, herunder cancer, stamceller og lægemiddeltoksicitet. Begrænsningen af fremgangsmåden ligger i lav overflod af overflademembranproteiner, således at en relativt stor mængde af prøver, der er nødvendige til denne analyse i forhold til undersøgelser centreret om cytosoliske proteiner.
Introduction
Celleoverfladeproteiner interagere med det ekstracellulære miljø og relæ signaler fra ydersiden til indersiden af en celle. Således er disse proteiner, herunder ekstracellulære matrix proteiner, spiller afgørende roller i alle aspekter af cellebiologi og fysiologi spænder fra spredning, vækst, migration, differentiering til aldring og så videre. Overfladeproteiner fungere ved interaktion med andre celler, proteiner og små molekyler 1-3. Molekylær karakterisering af celleoverfladeproteiner er af stor interesse ikke kun for biologer, men også til farmaceutiske virksomheder, hvor mere end 60% af lægemidler er målrettet til celleoverfladeproteiner 4.
Tandem massespektrometri (MS), med sin overlegne følsomhed, nøjagtighed og gennemløb til identifikation af proteiner og peptider, har været et effektivt redskab til globale proteom studier 5,6. Alligevel overfladeproteiner udgøre en betydelig udfordring for MS-baserede proteomics, somfindes de fleste overfladeproteiner i små mængder og med tunge modifikationer. De membranspændende regioner af overfladeproteiner gøre dem hydrofobe; dette er især tilfældet for MultiPass transmembrane proteiner. Det er derfor vanskeligt at opløse membranproteiner i vandige opløsninger uden hjælp fra et rengøringsmiddel; men anvendelsen af detergenter er generelt undertrykker udførelsen af HPLC og MS 1,7,8 protein identifikation. Derfor har membranproteiner er blevet dårligt karakteriseret i direkte LC-MS baserede proteomics.
Glycosylering er en af de vigtigste og mest udbredte post-translationelle modifikationer, der finder sted i celleoverfladeproteiner 9. Den enorme kompleksitet og heterogenitet glykaner hæmme peptider 'MS signal 10. Ikke desto mindre har flere proteom metoder denne unikke modifikation at berige overfladeproteiner og fjerne sukkergrupperne fra proteiner før LC-MS-analyse. Disse metodes omfatter lectin-baserede affinitetsindfangning 11 og hydrazid-baserede eller borsyre-baserede kemiske capture 12 samt hydrofile kromatografiske separationer 8,13. Fjernelsen af glykaner forvandler membranproteiner til almindelige proteiner og drastisk forenkler MS karakterisering. Fordi glykosylering finder også sted i udskilte proteiner, der har høj opløselighed i modsætning til membranproteiner, er mange glycoproteomic metoder optimeret til opløselige proteiner, og har tendens til at have lavere glycopeptid selektivitet og følsomhed, når bliver indsat til membranproteiner 8,14. Andre metoder findes også at berige navnlig celleoverfladeproteiner, såsom dem, der bruger ultracentrifugering 15 og mærkning strategier 16. En detaljeret sammenligning mellem vores metode og andre eksisterende metoder til karakterisering af membranproteiner blev foretaget for nylig 17, og resultaterne viste, at vores metode kan udføre lige så godt, hvis ikkebedre, end alle de sammenlignede membran proteomics metoder, men med højere enkelhed.
For at hjælpe forskerne bruge denne metode, vi detalje her en generel protokol. Denne metode integrerer adskillige fordele eksisterende glycoproteomics strategier, og der er udformet specielt til membranglycoproteiner, men metoden fungerer lige så godt for secernerede proteiner. Egenskaberne af denne fremgangsmåde omfatter: 1) en fuldstændig solubilisering af membranproteiner, 2) en berigelse af glycopeptider stedet for glycoproteiner at eliminere potentiel sterisk hindring, når der anvendes et fast indfangende substrat, 3) anvendelse af hydrazid kemi til dannelse af kovalente bindinger mellem glycopeptider og den indfangende substrat, således at de bundne glycopeptider kan tåle strenge vasker i høj glycoselectivity, og 4) evnen til at udføre hele indfangningsproceduren i et rør til mindre tab prøve og afkortet procedure varighed. Efter gennemførelsen af denne metode til at studere en variabelETY af biologiske prøver, herunder celler og væv, observerede vi en høj selektivitet (> 90%) til glycoproteiner 8,17,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her introducerer vi et glycopeptid-capture strategi for profilering celleoverfladeproteiner. Fremgangsmåden kan anvendes til at studere secernerede proteiner, såsom de i blod, såvel som i andre kropsvæsker eller celledyrkningsmedier.
Succesen af Metoden bygger på fuldstændig fordøjelse af prøver; Derfor er det nødvendigt med en SDS-PAGE karakterisering af fordøjelsen effektivitet, især for første gang en analyse af en prøve. En komplet fordøjelse kan være en udfordring f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning er blevet støttet af opstart fond af Simon Fraser University.
Materials
| DTT | Sigma | 646563 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Iodoacetamide | Sigma | A3221 | |
| Rapigest SF | Waters | 186001860 | |
| Sodium periodate | Sigma | 311448 | |
| PNGase F | New England Biolabs | P0704S | |
| Affi-Gel Hz Hydrazide gel | Bio-Rad | 153-6047 | |
| Trypsin | Worthington Biomedical | LS02115 | |
| Sep-Pak C-18 cartridge | Waters | WAT054955 | |
| Oasis MCX cartridge | Waters | 186000252 | |
| Protease inhibitor coctail | Sigma | P8340 | |
| Urea | Amersco | 568 | |
| Sodium sulphite | Caledon | 8360-1 | |
| Invertase | Sigma | I0408 | |
| Alpha-1 trypsin | Sigma | F2006 | |
| Ribonulease B | Sigma | R7884 | |
| Avidin | Sigma | A9275 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Conalbumin | Sigma | C0755 |
References
- Cho, W., Stahelin, R. V. Membrane-protein interactions in cell signaling and membrane trafficking. Annual review of biophysics and biomolecular structure. 34, 119-151 (2005).
- Tadevosyan, A., Vaniotis, G., Allen, B. G., Hebert, T. E., Nattel, S. G. protein-coupled receptor signalling in the cardiac nuclear membrane: evidence and possible roles in physiological and pathophysiological function. The Journal of physiology. 590, 1313-1330 (2012).
- White, S. H. Biophysical dissection of membrane proteins. Nature. 459, 344-346 (2009).
- Heijne, G. Membrane-protein topology. . Nature reviews Molecular cell biology. 7, 909-918 (2006).
- Cox, J., Mann, M. Quantitative high-resolution proteomics for data-driven systems biology. Annual review of biochemistry. 80, 273-299 (2011).
- Lamond, A. I., et al. Advancing cell biology through proteomics in space and time (PROSPECTS). Mol Cell Proteomics. 11, (2012).
- Savas, J. N., Stein, B. D., Wu, C. C., Yates 3rd, J. R. Mass spectrometry accelerates membrane protein analysis. Trends in biochemical sciences. 36, 388-396 (2011).
- Sun, B., et al. Shotgun glycopeptide capture approach coupled with mass spectrometry for comprehensive glycoproteomics. Mol Cell Proteomics. 6, 141-149 (2007).
- Lowe, J. B. Glycosylation, immunity, and autoimmunity. Cell. 104, 809-812 (2001).
- Dodds, E. D. Gas-phase dissociation of glycosylated peptide ions. Mass spectrometry reviews. 31, 666-682 (2012).
- Kaji, H., et al. Lectin affinity capture, isotope-coded tagging and mass spectrometry to identify N-linked glycoproteins. Nat Biotechnol. 21, 667-672 (2003).
- Zhang, H., Li, X. J., Martin, D. B., Aebersold, R. Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry. Nat Biotechnol. 21, 660-666 (2003).
- Hagglund, P., Bunkenborg, J., Elortza, F., Jensen, O. N., Roepstorff, P. A new strategy for identification of N-glycosylated proteins and unambiguous assignment of their glycosylation sites using HILIC enrichment and partial deglycosylation. J Proteome Res. 3, 556-566 (2004).
- Bond, M. R., Kohler, J. J. Chemical methods for glycoprotein discovery. Current opinion in chemical biology. 11, 52-58 (2007).
- Pasini, E. M., et al. In-depth analysis of the membrane and cytosolic proteome of red blood cells. Blood. 108, 791-801 (2006).
- Wollscheid, B., et al. Mass-spectrometric identification and relative quantification of N-linked cell surface glycoproteins. Nat Biotechnol. 27, 378-386 (2009).
- Sun, B., et al. N-Glycoproteome of E14.Tg2a mouse embryonic stem cells. PLoS ONE. 8, (2013).
- Sun, B., et al. Glycocapture-assisted global quantitative proteomics (gagQP) reveals multiorgan responses in serum toxicoproteome. J Proteome Res. 12, 2034-2044 (2013).
