Glycopeptide Capture for Cell Surface Proteomikk

Summary

Celleoverflateproteiner er biologisk viktig og allment glykosylert. Vi introduserer her en glycopeptide-fangst tilnærming til å oppløse, berike, og deglycosylate disse proteinene for lettvinte LC-MS basert proteomikk analyser.

Abstract

Celleoverflateproteiner, inkludert ekstracellulære matrix proteiner, delta i alle de store cellulære prosesser og funksjoner, slik som vekst, differensiering og spredning. En omfattende karakterisering av disse proteinene gir fyldig informasjon for biomarkører, celle-type identifikasjon, og narkotika-target utvalg, samt bidra til å fremme vår forståelse av cellebiologi og fysiologi. Overflateproteiner er imidlertid utgjøre betydelige analytiske utfordringer på grunn av deres iboende lave mengde av høy hydrofobisitet, og tunge post-translasjonelle modifikasjoner. Å dra nytte av den rådende glykosylering på overflateproteiner, innfører vi her en høy gjennomstrømming glycopeptide-fangst tilnærming som integrerer fordelene av flere eksisterende N-glycoproteomics midler. Vår metode kan berike glykopeptider utvunnet av overflateproteiner og fjerne sine glykaner for lettvinte proteomikk ved hjelp av LC-MS. Den løst N-glycoproteome omfatter informasjon av protein identitet og kvantitet så vel som sine områder av glykosylering. Denne metoden har vært brukt til en rekke studier i områder, inkludert kreft, stamceller, og narkotika toksisitet. Begrensningen av fremgangsmåten ligger i den lave mengde av overflatemembranproteiner, slik at et relativt stort antall av prøver er nødvendig for denne analyse sammenlignet med studier sentrert på cytosoliske proteiner.

Introduction

Celleoverflateproteiner kommuniserer med det ekstracellulære miljø og videresende signaler fra utsiden til innsiden av en celle. Således er disse proteinene, inkludert ekstracellulære matriksproteiner, spiller avgjørende roller i alle aspekter av cellulær biologi og fysiologi som strekker seg fra proliferasjon, vekst, migrering, differensiering til aldring og så videre. Overflateproteiner fungere ved å samhandle med andre celler, proteiner og små molekyler ^1-3. Molekylær karakterisering av celle-overflateproteiner er av stor interesse ikke bare for biologer, men også for farmasøytiske selskaper, som mer enn 60% av narkotika er målrettet mot celle-overflateproteiner ^fire.

Tandem massespektrometri (MS), med sin overlegne følsomhet, nøyaktighet og gjennomløp for identifisering av proteiner og peptider, har vært et kraftig verktøy for globale proteomic studier ^5,6. Likevel, overflateproteiner utgjøre betydelige utfordringer til MS-baserte proteomikk, somde fleste overflateproteiner finnes i lave mengder og med tunge modifikasjoner. Membran-spenner regioner av overflaten proteiner gjør dem hydrofobe; Dette er særlig tilfelle for multipass transmembrane proteiner. Det er således vanskelig å løse opp membranproteiner i vandige oppløsninger uten hjelp av en detergent; men bruken av vaskemidler generelt undertrykker utførelsen av HPLC og MS ^1,7,8 i protein identifikasjon. Derfor har membran proteiner er dårlig karakterisert i direkte LC-MS basert proteomikk.

Glykosylering er en av de viktigste og mest rikelig post-translasjonelle modifikasjoner som finner sted i celle-overflateproteiner ^9. Den enorme kompleksitet og heterogenitet av glykaner hemme peptider 'MS signal ^10. Likevel har flere proteomikk metoder brukt denne unike modifisering å berike overflateproteiner og å fjerne sukkerdelene fra proteiner før LC-MS analyse. Disse metodes omfatter lektin-basert affinitet capture ¹¹ og hydrazid-baserte eller borsyre-basert kjemisk capture ¹² så vel som hydrofile kromatografiske separasjoner ^8,13. Fjerning av glykaner forvandles membran proteiner til vanlige proteiner og drastisk forenkler MS karakterisering. Fordi glykosylering forekommer også i utskilte proteiner som har høy oppløselighet i motsetning til membran proteiner, er mange glycoproteomic metoder optimalisert for løselige proteiner, og har en tendens til å ha lavere glykopeptid selektivitet og følsomhet når det blir utplassert til membran proteiner ^8,14. Andre metoder finnes også for å berike, særlig celle-overflateproteiner, slik som de ved hjelp av ultrasentrifugering ¹⁵ og merking strategier ^16. En detaljert sammenligning mellom vår fremgangsmåte og andre eksisterende metoder for å karakterisere membranproteiner ble utført nylig ^17, og resultatene indikerte at vår metode kan utføre like godt, om ikkebedre enn alle de sammenlignede membran proteomikk metoder, men med større enkelhet.

For å hjelpe forskere bruker denne metoden, vi detalj her en generell protokoll. Denne fremgangsmåten integrerer flere fordeler på eksisterende glycoproteomics strategier, og er utviklet spesielt for membran-glykoproteiner, men metoden fungerer like godt for utskilte proteiner. Det som kjennetegner denne fremgangsmåten innbefatter: 1) en fullstendig oppløsning av membranproteiner, 2) en berikelse av glykopeptider istedenfor glykoproteiner for å eliminere den potensielle steriske hindring ved bruk av en faststoff fange substrat, 3) ved bruk av kjemi-hydrazid for å danne kovalente bindinger mellom glykopeptider og fange substrat, slik at de bundne glykopeptider tåler høye vaskinger for høy glycoselectivity, og 4) evnen til å utføre hele fangst prosedyren i ett rør for redusert prøvetap og forkortet prosedyre varighet. Etter gjennomføring av denne metoden for å studere en variety av biologiske prøver, inkludert celler og vev, ble det observert en høy selektivitet (> 90%) for å glykoproteiner ^8,17,18.

Protocol

En. Slakte Membraner Legg hypotonisk buffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, pH 8,0) med protease inhibitor cocktail på en cellepellet (~ 10 8 celler) og inkuberes i 15-30 minutter på is. Lyse av celler ved å føre prøven gjennom sprøytenåler (5-10 Pass) eller homogenisere prøven ved en Douce-homogenisator (15-30 slag). Bruk et hemocytometer og trypan blå farging for å undersøke effektiviteten av lysis. Tak i den mikrosomale fraksjon av en differensialsentrif…

Representative Results

Et representativt flytskjema over den eksperimentelle fremgangsmåten er sammenfattet i figur 1.. Merkingen og ytterligere fraksjone trinn er valgfritt, og detaljer er beskrevet i en nylig publikasjon 18.. Et annet alternativ er å analysere de umodifiserte peptider, som ikke reagerer med harpiksen. Fordelene med å analysere de umodifiserte peptider omfatter den potensielle identifisering av ikke-glykosylerte peptider og proteiner, slik som Claudins i trange veikryss; en ekstra fordel er mer…

Discussion

Her introduserer vi en glycopeptide-fangst strategi for profilering celle-overflateproteiner. Fremgangsmåten kan brukes til å studere utskilte proteiner, slik som de i blodet samt i andre kroppsvæsker eller i cellekulturmediet.

Suksessen til den metoden er avhengig av den komplette fordøyelsen av prøver; Derfor, er en SDS-PAGE karakterisering av fordøyelseseffektivitet nødvendig, spesielt for det første tids analyse av en prøve. En komplett fordøyelse kan være utfordrende for memb…

Materials

DTT	Sigma	646563
TCEP	Sigma	646547
Iodoacetamide	Sigma	A3221
Rapigest SF	Waters	186001860
Sodium periodate	Sigma	311448
PNGase F	New England Biolabs	P0704S
Affi-Gel Hz Hydrazide gel	Bio-Rad	153-6047
Trypsin	Worthington Biomedical	LS02115
Sep-Pak C-18 cartridge	Waters	WAT054955
Oasis MCX cartridge	Waters	186000252
Protease inhibitor coctail	Sigma	P8340
Urea	Amersco	568
Sodium sulphite	Caledon	8360-1
Invertase	Sigma	I0408
Alpha-1 trypsin	Sigma	F2006
Ribonulease B	Sigma	R7884
Avidin	Sigma	A9275
Ovalbumin	Sigma	A5503
Conalbumin	Sigma	C0755