薄層クロマトグラフィー（TLC）分離および植物抽出物のバイオアッセイは、抗菌化合物を同定するために
Summary
方法は、植物抽出物の薄層クロマトグラフ（TLC）分離および抗菌性代謝物を同定するためのコンタクトバイオオートグラフィーのために記載されている。方法は、ウシ第一胃にネイティブ過剰のアンモニア産生菌（HAB）を阻害レッドクローバーフェノール化合物のスクリーニングに適用される。
Abstract
植物の抗微生物化合物のための共通の画面（ 例えば 、真菌又は細菌ブロスまたは寒天）、微生物のための時間には成長させる微生物の懸濁液にクロマトグラムを露出させる、紙又は薄層クロマトグラフィー（PC又はTLC）によって植物抽出物を分離することから成り湿った環境、無微生物の増殖のゾーンを可視化する。バイオオートグラフィーとして知られているこのスクリーニング方法の有効性は、クロマトグラフィー分離の品質および微生物の培養条件で撮影されたケアの両方に依存する。本稿では、酸発酵菌アミノための新しいアプリケーションと、TLCおよびコンタクトバイオオートグラフィーのための標準的なプロトコルについて説明します。抽出液を可撓性（アルミニウムで裏打ち）シリカTLCプレート上で分離し、バンドを紫外線（UV）光下で可視化する。ゾーンは、試験微生物を接種した寒天上に切り出し、表面を下にインキュベートする。阻害バンドは寒天プレートを染色することによって可視化されるsのテトラゾリウム赤。この方法は、レッドクローバー（ アカツメクサ品種 。Kenland）フェノール性化合物およびクロストリジウムsticklandii、ウシ第一胃にネイティブなハイパーアンモニア生産菌（HAB）に対する活性のための彼らのスクリーニングの分離に適用されます。 TLC法は、（好気性または嫌気性）、ならびに菌類植物抽出物及び他の細菌種の多くの種類に適用される培養条件は、種の成長要件に適合するように変更された場合に、試験生物として使用することができる。
Introduction
植物中の抗菌性化合物をアッセイすることは、植物抽出物の成分を分離するこれらのコンポーネントに試験微生物を露出し、微生物の増殖が化合物のいずれかによって阻害されるかどうかを決定する必要である。多くの化合物は、平坦な表面上で分離することができるので、紙又は薄層クロマトグラフィー（PC又はTLC）による分離が便利である。分離は、いくつかの化合物が吸着剤（パソコンの場合には、セルロース、およびTLCの場合、吸着剤の品種）に強固に結合し、他の1未満の移行で、極性に基づいています。 図1の相対位置の例を示していますシリカTLCプレート上で分離した後、極性および非極性のフェノール化合物。
図1。シリカ薄層クロマトグラフィー（TLC）プレート上の分離後に異なる極性の化合物の分布を示す図。アカツメクサ（ トリフォチモシー L.）のフェノール化合物は、実施例として使用される。パーティションより容易なclovamideなどの極性化合物、シリカのような極性の吸着剤への強い親和性を有し、原点（OR）の近くに残っている、そのような溶媒先端（SF）に近い3イソフラボンなどの極性の低い化合物、しばらく、溶剤へ（水、酸、または塩基が含まれている場合を除き、シリカよりも極性である）と、遠くプレートまで移動する。
TLCプレート上で抽出物を分離した後、試験微生物は、このように抽出物2の活性成分の同定を迅速化、プレート上の全ての化合物に暴露することができる。真菌や細菌培養がクロマトグラムにさらされている場合は、微生物の増殖は、成長阻害剤を用いた領域上を除いてどこでも発生しますYの化合物。真菌細胞を生きた4により低減又は加水分解されたときに色を変更する化合物を噴霧することにより3または適用された場合に阻害ゾーンは、その後、菌糸体の成長および増殖を含まない領域とのコントラストを観察することによって視覚化することができる。抗菌性アッセイのための紙又は薄層クロマトグラムの使用は、第5の抗生物質及び殺菌剤3,6に適用したが、植物抽出物は、現在、頻繁に、しばしばバイオオートグラフィーと称されるこの方法では、抗菌性化合物についてスクリーニングされる。ここに記載されたプロトコルは、薄層クロマトグラムのバイオオートグラフィーに適用されます。それは比較的迅速であり、異なる吸着剤（ 例えば 、シリカ、デンプン、アルミナ）、ならびに良好な解像度及び感度1を提供することで行うことができるので、TLCが広く用いられている。
植物抽出物は、多くの方法でTLCのために調製することができる。一般的な方法は、ALCで抽出植物材料を含むそのような可能性の酸または塩基9を添加し、80％エタノール、7,8、等ohol -水の混合物である。彼らは最小容量のTLCプレートに適用することができるように、いくつかの水を含んでいて、おそらく酸性または塩基性であり、このような溶媒中で抽出後、抽出液を濃縮する必要があります。アルコール-水抽出物の濃度は、水非混和性有機溶媒8または例えば酢酸エチル-エチルエーテル（1:1、v / v）の10,11のような溶媒の混合物を分割することによって達成することができる。異なる植物代謝産物は、その極性に応じて、異なる有機溶媒中に抽出される。その植物有機酸または塩基がこの段階で有機溶媒中に抽出されるように、アルコール – 水抽出物のpHを上昇またはその後であり、それらの非解離形へと解離した分析物を変換するための水溶性の酸または塩基を低下させることができる中性有機溶剤に可溶で9。有機相をEすることができます減圧下、または窒素下でvaporatedとTLC用所望の容量に調整した。抽出液のpHを中性溶剤、小さな最終容量、および分離前にTLCプレート上の抽出物の蒸発への検体のパーティショニングによるバイオアッセイの微生物に対して致死的になることはほとんどありません。
真菌および細菌の両方は、植物抽出物2のバイオオートグラフィーの試験微生物として使用される。栄養溶液中でプレート上に噴霧し、数日3湿潤環境でインキュベートした場合などクラドスポリウムククメリヌムなどの一部の真菌の胞子は、TLCプレート（別に阻害化合物を用いた地域からの）上で発芽する。 Cの暗い菌糸非阻害性のゾーンにククメリヌムは菌糸成長のフリーゾーンに鋭い対照を提供しています。細菌は、同様に4,12薄層クロマトグラフィー（TLC）プレートに適用されてきたが、細菌はまた、TLC上に注ぐ寒天オーバーレイ中の板面13,14。例えば、 カンジダ·アルビカンス（Candida albicans）などの酵母は、、ならびに14寒天オーバーレイを適用することができる。あるいは、TLCプレート10,15は、細菌または酵母8、コンタクトバイオオートグラフィー2として知られている方法で接種した寒天上にフェイスダウンで載置することができる。
私たちは、レッドクローバー（ アカツメクサ品種 。Kenland）から抗菌フェノール化合物をスクリーニングするために、コンタクトバイオオートグラフィーのための方法が記載されている。試験微生物は、 クロストリジウム·sticklandii、第一胃ハイパーアンモニア生産菌（HAB）で、嫌気性菌を義務づける。使用分離は抽出物のすべてのコンポーネントを解決しないが、彼らはこのように可能な抗菌性化合物のプールを狭め、抗菌活性のゾーンの識別を容易にする。プロトコルは、TLC 1のための標準的な手順を利用しています。プロトコルは、培養obliに必要な技術のいくつかを説明このようなアッセイのためのゲート嫌気性菌、生細胞2,4を染色するテトラゾリウム塩、接触バイオオートグラフィー15と可視化手法の利用。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、化合物の部分集合に抽出分離し、接触バイオオートグラフィーにより、これらのサブセットを分析するための簡単な方法を説明します。この方法は、淋病を引き起こす細菌に対する阻害植物代謝をスクリーニングするChomnawang ら 15によって使用されるものとよく似ています。抗菌植物化合物をスクリーニングするために使用されるバイオオートグラフィ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、私たちは、この研究のために彼の赤いクローバーのプロットからサンプルを使用できるようにするための、ケンタッキー大学遅く博士ノーム·テイラー、専攻植物や土壌学に感謝。このプロジェクトは、米国農務省によって資金を供給された。
Materials
| Silica F254 TLC plates, aluminum-backed, 0.2 mm thickness, 20 × 20 cm | EMD Chemicals | 5554/7 | These plates are coated with silica that contains an indicator fluorescing at 254 nm. Compounds absorbing at that wavelength appear dark on a fluorescent green background. Alternative sources include Analtech, Selecto Scientific, Fluka. Adsorbents other than silica may be needed. Plastic-backed plates may be suitable, depending on the solvents to be used. |
| Sharp, heavy-duty scissors | any sewing supply company | similar to Fiskars 175800-1002 | For cutting TLC plates. A paper cutter with a sharp blade can be used as well. Do not inhale silica dust. |
| Drying oven at 100 °C (mechanical convection) | Thermo Scientific | PR305225M | Quincy Lab, Inc, Chicago, IL (www.quincylab.com); Cascade Technical Sciences, Hillsboro, OR (www.cascadetek.com) |
| TLC chamber | Kimble Chase | 416180-0000 | Alternative sources: Aldrich. Pyrex beakers or preserving jars can be used for small plates (i.e. 5 × 10 cm). Cover with aluminum foil (jar lids may contain material extractable by solvent vapors). |
| 50-µL syringe with flat needle tip | Hamilton | 80965 | For loading amounts of standard or sample exceeding 5-10 µL. Alternative sources are equivalent. |
| micropipets | Drummond | 2-000-001 | For loading small amounts of standards or samples. Alternative sources: VWR. Also, Pasteur pipets can be stretched to a thinner diameter with a butane torch. |
| Filter paper (#1 grade) | Whatman | 1001 917 | Serves as a chamber wick. Other grades of filter paper are OK. This size can be trimmed for the chambers holding 20 × 20 cm plates. |
| Beaker tongs | Fisher Scientific | 15-186 | For putting plates in and out of a large TLC chamber. Alternate sources: VWR |
| Flat-edge forceps | Fisher Scientific | 10-275 | For putting plates in and out of a small chamber. Alternate sources: VWR |
| Small portable UV lamp with 4-Watt or 6-Watt bulbs for short- and long-wave UV light illumination (254 and 365 nm, respectively) | Ultraviolet Products | 95-0271-01 | Alternate sources: Spectronics Corporation (www.spectroline.net) |
| Viewing cabinet for use with hand-held UV lamp | Ultraviolet Products | Chromato-Vue C-10E | UV-active bands are more easily circled if plates can be set in here. Alternate sources: Spectronics Corporation. |
| Photodocumentation system with overhead UV lamp and visible lamp | Kodak | Gel Logic 200 | Alternate sources: Ultraviolet Products (www.uvp.com). See protocol for homemade alternative. |
| Anaerobic Chamber, Type A, Vinyl | Coy | 7150000 | This chamber is appropriate for anaerobic bacteria, like Clostridium sticklandii, as described. However, growth conditions must be tailored to organism used in the assay. A biosafety cabinet and other precautions should be taken if pathogenic organisms are used. Alternate sources: Anaerobe Systems, BioRad, Plas Labs, others |
| Tetrazolium red | Sigma-Aldrich | T8877 | Alternate sources: MP Biomedicals, Santa Cruz Biotechnology, Alfa Aesar |
| Ingredients for HAB media | |||
| Pyridoxamine · 2 HCl | Sigma-Aldrich | P9380 | For this and for all the other reagents in this table, alternative sources are equivalent. |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | R4500 | |
| Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T3902 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N3376 | |
| Calcium D-Pantothenate | Sigma-Aldrich | C8731 | |
| Lipoic Acid | Sigma-Aldrich | T5625 | |
| p-Aminobenzoic acid | Sigma-Aldrich | A9878 | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8798 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | |
| Cobalamine | Sigma-Aldrich | C3607 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P9130 | |
| Pyridoxine | Sigma-Aldrich | P5669 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Iron sulfate · 7 H2O | Sigma-Aldrich | F8263 | |
| Zinc sulfate · 7 H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
| Manganese chloride · 4 H2O | Sigma-Aldrich | M8054 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Cobalt chloride · 6 H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| Copper chloride · 2 H2O | Sigma-Aldrich | 459097 | |
| Nickel chloride · 6 H2O | Sigma-Aldrich | 203866 | |
| Sodium molybdate · 2 H2O | Sigma-Aldrich | 331058 | |
| Trypticase (Pancreatic digest of casein) | Thermo Fisher | B11921 | |
| Potassium phosphate monobasic anhydrous | Thermo Fisher | P284 | |
| sodium carbonate · H2O | Thermo Fisher | S636 | |
| Agar | Thermo Fisher | 50841063 | |
| Magnesium sulfate · 6 H2O | Thermo Fisher | 7791-18-6 | |
| Calcium chloride · 2 H2O | Thermo Fisher | BP510 | |
| Cysteine HCl | Thermo Fisher | 19464780 | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous | Thermo Fisher | P290 | |
| Sodium chloride | Thermo Fisher | BP358 |
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