Тонкослойная Хроматографическое (ТСХ) Разделение и Биоанализы растительных экстрактов для идентификации антимикробные соединения
Summary
Описаны методы тонкослойной хроматографии (ТСХ) разделения растительных экстрактов и контактной bioautography выявления антибактериальных метаболитов. Методы применяются к скрининга клевера лугового фенольных соединений, ингибирующих гипер аммиака бактерии-продуцента (ВЦВ) родные к бычьей рубце.
Abstract
Общий экран для растений антимикробных соединений состоит из разделения растительных экстрактов на бумаге или тонкослойной хроматографии (ПК или ТСХ), подвергая хроматограммы в микробных суспензий (например, грибы или бактерии в бульон или агар), позволяя время для микробов расти в влажной среде, и визуализации зон, не микробного роста. Эффективность этого метода скрининга, известный как bioautography, зависит как от качества хроматографическим разделением и на тщательные с микробными условиях культивирования. Эта статья описывает стандартные протоколы для ТСХ и контактной bioautography с новым приложением для аминокислотных брожения бактерий. Экстракт отделяют на гибких (алюминий спинкой) кремнезема ТСХ пластин, и полосы визуализируются под ультрафиолетовым (УФ) света. Зоны вырезать и инкубировали лицевой стороной вниз на агаре инокулировали с тест-микроорганизма. Тормозные полосы визуализировали окрашиванием агара пластиныс с тетразолий красный. Метод применяется к разделению красного клевера (клевер луговой резюме. Kenland) фенольных соединений и их скрининга на активность в отношении Clostridium sticklandii, гипер аммиака производящих бактерии (ВЦВ), что является родным для крупного рогатого скота рубце. ТСХ методы применимы ко многим типам растительных экстрактов и других видов бактерий (аэробных или анаэробных), а также грибов, могут быть использованы в качестве тестовых организмов, если условия культивирования модифицированы, чтобы соответствовать требованиям роста видов.
Introduction
Анализа на антимикробных соединений в растениях требует разделения компонентов растительного экстракта, подвергая тест-микроорганизма в тех компонентов, и определения, является ли рост микроорганизма в ингибируется любого из соединений. Разделение с помощью бумажной или тонкослойной хроматографии (ПК или ТСХ) удобны тем, что многие соединения могут быть разделены на плоской поверхности. Разделение основано на полярности, при этом некоторые соединения связывания крепко адсорбента (целлюлозы в случае ПК, а также ряд адсорбентов в случае ТСХ) и миграции меньше, чем другие 1. Рисунок 1 дает пример взаимного расположения полярные и неполярные фенольные соединения после разделения на диоксид кремния ТСХ пластины.
Рисунок 1. Диаграмма, иллюстрирующая распределение соединений различной полярности после разделения на силикагеле, тонкослойной хроматографии (ТСХ) пластины. Фенольные соединения из красного клевера (Trifolium луговой L.) используются в качестве примера. Полярные соединения, такие как clovamide, имеют сильное сродство к полярным адсорбентом, как диоксид кремния и остаются вблизи начала координат (OR), а менее пол рные соединени, такие как три изофлавонов вблизи фронта растворителя (SF), раздел более легко в растворителях (которые являются менее полярным, чем кремнезема, если вода, кислоты, основания или не включены) и мигрировать дальше вверх пластины.
После отделения экстракта на ТСХ пластине, тестовые микроорганизмы могут подвергаться воздействию всех соединений на пластине, тем самым ускоряя идентификацию активных компонентов экстракта 2. Если грибковая или бактериальная культура подвергается хроматограмме, микробный рост будет происходить везде, кроме над районами с роста-ингибиторау соединения. Зон ингибирования могут быть визуализированы при наблюдении контраст между мицелия и областей роста свободной если грибы были применены три или распылением с соединениями, которые меняют цвет, когда уменьшается или гидролизованный живыми клетками, 4. Хотя использование бумажных или тонкослойных хроматограмм для антимикробных анализов был впервые применен к антибиотикам 5 и фунгицидов 3,6, растительные экстракты в настоящее время часто скрининг на антимикробных соединений с этим методом, часто упоминается как bioautography. Протоколы, описанные здесь, относятся к bioautography тонкослойных хроматограмм. ТСХ широко используется, потому что это относительно быстрый и могут быть выполнены на различных адсорбентов (например, кремнезема, крахмал, оксид алюминия), а также обеспечивает хорошую разрешение и чувствительность 1.
Растительные экстракты могут быть подготовлены для ТСХ во многих отношениях. Общие методы включают извлекающий растительный материал в алкohol-водные смеси, такие как 80%-ного этанола 7,8, возможно, с добавлением кислоты или основания 9. После экстракции в таких растворителей, содержащих воду и, возможно, кислой или основной, экстракты должны быть сконцентрированы, так что они могут быть применены к пластинах ТСХ в минимальном объеме. Концентрация алкоголя водных экстрактов может быть достигнуто путем разделения с несмешивающихся с водой органических растворителей 8 или смесью этих растворителей, таких как этилацетат-этиловый эфир (1:1, об / об) 10,11. Различные метаболиты растений экстрагировали в различных органических растворителей, в зависимости от их полярности. Чтобы гарантировать, что растительные органические кислоты или основания извлекаются в органических растворителях на этой стадии, рН экстракта водно-спиртовой может быть повышена или понижена с водорастворимой кислоты или основания для преобразования диссоциированных аналитов в их недиссоциированных форм, которые затем растворимый в нейтральных органических растворителях 9. Органическую фазу может быть адресvaporated при пониженном давлении или в атмосфере азота и доводили до требуемого объема для ТСХ. РН экстракта вряд ли будет смертельным для биопроб микроорганизмов за счет разбиения аналитов в нейтральных растворителей, небольшой конечного объема, и испарения экстракта на ТСХ пластине перед разделением.
Оба грибки и бактерии используют в качестве тестовых микроорганизмов в bioautography растительных экстрактов 2. Споры некоторых грибов, таких как Cladosporium cucumerinum, прорастают на пластинах ТСХ (кроме областей с ингибирующих соединений) если распыляют на пластинах в питательном растворе и инкубировали во влажной среде в течение нескольких дней 3. Темная мицелий С. cucumerinum на noninhibitory зон обеспечивает резкий контраст зон, свободных от роста мицелия. Хотя бактерии были применены к тонкослойной хроматографии (ТСХ) пластин таким же образом, 4,12, бактерии также выливают на ТСХповерхности пластины в агар перекрывает 13,14. Дрожжи, таких как Candida Albicans, может быть применен в чашках с накладками, а 14. Кроме того, ТСХ пластины могут быть размещены лицевой стороной вниз на агаре инокулировали с бактерий или дрожжей 10,15 8, способом, известным как контактное bioautography 2.
Мы опишем метод для контактной bioautography для выявления противомикробных фенольных соединений из красного клевера (клевер луговой CV. Kenland). Тест микроорганизм Clostridium sticklandii, рубца гипер аммиака бактерия-продуцент (ВЦВ) и обязать анаэробные. Хотя разделение используемые не решают все компоненты экстракта, они облегчают идентификацию зон антимикробной активности, таким образом, сужение круга возможных противомикробным соединений. Протокол использует стандартные процедуры для ТСХ 1. Протокол также описывает некоторые из методов, необходимых для культивирования обяворота анаэробы для такого анализа, использование контактной bioautography 15 и способу визуализации с тетразолиевого соли, которая окрашивает живые клетки 2,4.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает простой способ разделения выписку на подмножества соединений и анализируя эти подмножества контактным bioautography. Метод очень похож на одного используемой Chomnawang др.. 15 для выявления метаболитов растений ингибирующих чтобы гонореей бактерий. Тип bioautograph…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим покойный д-р Норма Тейлор, Средств растительного и почвенного наук в Университете штата Кентукки, за предоставленную нам возможность использовать образцы из своих красных клевера участков для данного исследования. Этот проект финансировался США Департамент сельского хозяйства.
Materials
| Silica F254 TLC plates, aluminum-backed, 0.2 mm thickness, 20 × 20 cm | EMD Chemicals | 5554/7 | These plates are coated with silica that contains an indicator fluorescing at 254 nm. Compounds absorbing at that wavelength appear dark on a fluorescent green background. Alternative sources include Analtech, Selecto Scientific, Fluka. Adsorbents other than silica may be needed. Plastic-backed plates may be suitable, depending on the solvents to be used. |
| Sharp, heavy-duty scissors | any sewing supply company | similar to Fiskars 175800-1002 | For cutting TLC plates. A paper cutter with a sharp blade can be used as well. Do not inhale silica dust. |
| Drying oven at 100 °C (mechanical convection) | Thermo Scientific | PR305225M | Quincy Lab, Inc, Chicago, IL (www.quincylab.com); Cascade Technical Sciences, Hillsboro, OR (www.cascadetek.com) |
| TLC chamber | Kimble Chase | 416180-0000 | Alternative sources: Aldrich. Pyrex beakers or preserving jars can be used for small plates (i.e. 5 × 10 cm). Cover with aluminum foil (jar lids may contain material extractable by solvent vapors). |
| 50-µL syringe with flat needle tip | Hamilton | 80965 | For loading amounts of standard or sample exceeding 5-10 µL. Alternative sources are equivalent. |
| micropipets | Drummond | 2-000-001 | For loading small amounts of standards or samples. Alternative sources: VWR. Also, Pasteur pipets can be stretched to a thinner diameter with a butane torch. |
| Filter paper (#1 grade) | Whatman | 1001 917 | Serves as a chamber wick. Other grades of filter paper are OK. This size can be trimmed for the chambers holding 20 × 20 cm plates. |
| Beaker tongs | Fisher Scientific | 15-186 | For putting plates in and out of a large TLC chamber. Alternate sources: VWR |
| Flat-edge forceps | Fisher Scientific | 10-275 | For putting plates in and out of a small chamber. Alternate sources: VWR |
| Small portable UV lamp with 4-Watt or 6-Watt bulbs for short- and long-wave UV light illumination (254 and 365 nm, respectively) | Ultraviolet Products | 95-0271-01 | Alternate sources: Spectronics Corporation (www.spectroline.net) |
| Viewing cabinet for use with hand-held UV lamp | Ultraviolet Products | Chromato-Vue C-10E | UV-active bands are more easily circled if plates can be set in here. Alternate sources: Spectronics Corporation. |
| Photodocumentation system with overhead UV lamp and visible lamp | Kodak | Gel Logic 200 | Alternate sources: Ultraviolet Products (www.uvp.com). See protocol for homemade alternative. |
| Anaerobic Chamber, Type A, Vinyl | Coy | 7150000 | This chamber is appropriate for anaerobic bacteria, like Clostridium sticklandii, as described. However, growth conditions must be tailored to organism used in the assay. A biosafety cabinet and other precautions should be taken if pathogenic organisms are used. Alternate sources: Anaerobe Systems, BioRad, Plas Labs, others |
| Tetrazolium red | Sigma-Aldrich | T8877 | Alternate sources: MP Biomedicals, Santa Cruz Biotechnology, Alfa Aesar |
| Ingredients for HAB media | |||
| Pyridoxamine · 2 HCl | Sigma-Aldrich | P9380 | For this and for all the other reagents in this table, alternative sources are equivalent. |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | R4500 | |
| Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T3902 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N3376 | |
| Calcium D-Pantothenate | Sigma-Aldrich | C8731 | |
| Lipoic Acid | Sigma-Aldrich | T5625 | |
| p-Aminobenzoic acid | Sigma-Aldrich | A9878 | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8798 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | |
| Cobalamine | Sigma-Aldrich | C3607 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P9130 | |
| Pyridoxine | Sigma-Aldrich | P5669 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Iron sulfate · 7 H2O | Sigma-Aldrich | F8263 | |
| Zinc sulfate · 7 H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
| Manganese chloride · 4 H2O | Sigma-Aldrich | M8054 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Cobalt chloride · 6 H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| Copper chloride · 2 H2O | Sigma-Aldrich | 459097 | |
| Nickel chloride · 6 H2O | Sigma-Aldrich | 203866 | |
| Sodium molybdate · 2 H2O | Sigma-Aldrich | 331058 | |
| Trypticase (Pancreatic digest of casein) | Thermo Fisher | B11921 | |
| Potassium phosphate monobasic anhydrous | Thermo Fisher | P284 | |
| sodium carbonate · H2O | Thermo Fisher | S636 | |
| Agar | Thermo Fisher | 50841063 | |
| Magnesium sulfate · 6 H2O | Thermo Fisher | 7791-18-6 | |
| Calcium chloride · 2 H2O | Thermo Fisher | BP510 | |
| Cysteine HCl | Thermo Fisher | 19464780 | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous | Thermo Fisher | P290 | |
| Sodium chloride | Thermo Fisher | BP358 |
References
- Stahl, E., Ashworth, M. R. F. . Thin-layer chromatography. , (1969).
- Marston, A. Thin-layer chromatography with biological detection in phytochemistry. J. Chromatogr. A. 1218 (19), 2676-2683 .
- Homans, A. L., Fuchs, A. Direct bioautography on thin-layer chromatograms as a method for detecting fungitoxic substances. J. Chromatogr. 51, 327-329 .
- Lund, B. M., Lyon, G. D. Detection of inhibitors of Erwinia carotovora and E. herbicola on thin-layer chromatograms. J. Chromatogr. 110, 193-196 (1975).
- Betina, V. Bioautography in paper and thin-layer chromatography and its scope in the antibiotic field. J. Chromatogr. A. 78, 41-51 (1973).
- Weltzien, H. C. Ein biologischer Test für fungizide Substanzen auf dem Papierchromatogramm. Naturwissenschaften. 45, 288-289 (1958).
- Khurram, M., Khan, A. M., Hameed, A., Abbas, N., Quayum, A., Inayat, H. Antibacterial activities of Dodonaea viscosa using contact bioautography technique. Molecules. 14 (3), 1332-1341 (2009).
- Khurram, M., et al. Evaluation of anticandidal potential of Quercus baloot Griff. using contact bioautography technique. Afr. J. Pharm. Pharmacol. 5 (12), 1538-1542 (2012).
- Robinson, T. . The Organic Constituents of Higher Plants. , (1963).
- Kagan, I. A., Flythe, M. D. Factors affecting the separation and bioactivity of red clover (Trifolium pratense) extracts assayed against Clostridium sticklandii, a ruminal hyper ammonia-producing bacterium. Nat. Prod. Commun. 7 (12), 1605-1608 (2012).
- Mattila, P., Kumpulainen, J. Determination of free and total phenolic acids in plant-derived foods by HPLC with diode-array detection. J. Agric. Food Chem. 50 (13), 3660-3667 (2002).
- Hamburger, M. O., Cordell, G. A. A direct bioautographic TLC assay for compounds possessing antibacterial activity. J. Nat. Prod. 50 (1), 19-22 (1987).
- Flythe, M., Kagan, I. Antimicrobial effect of red clover (Trifolium pratense) phenolic extract on the ruminal hyper ammonia-producing bacterium, Clostridium sticklandii. Curr. Microbiol. 61, 125-131 .
- Rahalison, L., Hamburger, M., Hostettmann, K., Monod, M., Frenk, E. A bioautographic agar overlay method for the detection of antifungal compounds from higher plants. Phytochem. Anal. 2 (5), 199-203 (1991).
- Chomnawang, M. T., Trinapakul, C., Gritsanapan, W. In vitro antigonococcal activity of Coscinium fenestratum stem extract. J. Ethnopharmacol. 122, 445-449 (2009).
- Stahl, E., Kaldewey, H. Spurenanalyse physiologisch aktiver, einfacher Indolderivate. Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem. 323, 182-191 .
- Kagan, I. A., Hammerschmidt, R. Arabidopsis ecotype variability in camalexin production and reaction to infection by Alternaria brassicicola. J. Chem. Ecol. 28 (11), 2121-2140 (2002).
- Kline, R. M., Golab, T. A simple technique in developing thin-layer bioautographs. J. Chromatogr. 18, 409-411 (1965).
- Wedge, D. E., Nagle, D. G. A new 2D-TLC bioautography method for the discovery of novel antifungal agents to control plant pathogens. J. Nat. Prod. 63 (8), 1050-1054 (2000).
- Beck, A. B., Knox, J. R. The acylated isoflavone glycosides from subterranean clover and red clover. Aust. J. Chem. 24 (7), 1509-1518 (1971).
- Kahn, R. A., Bak, S., Svendsen, I., Halkier, B. A., Møller, B. L. Isolation and reconstitution of cytochrome P450ox and in vitro reconstitution of the entire biosynthetic pathway of the cyanogenic glucoside dhurrin from sorghum. Plant Physiol. 115 (4), (1997).
- Peterson, C. A., Edgington, L. V. Quantitative estimation of the fungicide benomyl using a bioautograph technique. J. Agr. Food Chem. 17 (4), 898-899 (1969).
