Summary

Tyndtlagskromatografisk (TLC) Separations og Bioassays planteekstrakter til at identificere antimikrobielle forbindelser

Published: March 27, 2014
doi:

Summary

Fremgangsmåder er beskrevet til tyndtlags kromatografi (TLC) adskillelse af planteekstrakter og kontakt bioautografi til at identificere antibakterielle metabolitter. De metoder, der anvendes til screening af rødkløver phenolforbindelser inhiberer hyper ammoniak-producerende bakterier (HAB) er native for bovin vommen.

Abstract

En fælles skærm for vegetabilske antimikrobielle forbindelser består af adskillelse planteekstrakter af papir eller tyndtlagskromatografi (PC eller TLC), udsætter kromatogrammerne mikrobielle suspensioner (f.eks svampe eller bakterier i bouillon eller agar), giver tid til mikroorganismerne til at vokse i et fugtigt miljø, og visualisere zoner uden mikrobiel vækst. Effektiviteten af ​​denne screeningsmetode, der er kendt som bioautografi, afhænger både kvaliteten af ​​kromatografisk separation og omhu med mikrobielle dyrkningsbetingelser. Dette papir beskriver standard protokoller for TLC og kontakt bioautografi med en roman ansøgning til aminosyre-gærende bakterier. Ekstrakten separeres på fleksible (aluminium-backed) silica TLC-plader, og bands visualiseres under ultraviolet lys (UV). Zoner er skåret ud og inkuberes med forsiden nedad på agar podet med test mikroorganisme. Inhiberende bånd visualiseret ved farvning agarpladens med tetrazolium rød. Metoden anvendes til adskillelse af rødkløver (Trifolium pratense cv. Kenland) phenolforbindelser og deres screening for aktivitet mod Clostridium sticklandii, en hyper ammoniak-producerende bakterie (HAB), som er hjemmehørende i den bovine vommen. TLC metoder gælder for mange typer planteekstrakter og andre bakteriearter (aerobe eller anaerobe), samt svampe, kan anvendes som testorganismer hvis dyrkningsbetingelserne er modificeret til at passe til kravene i de arter vækst.

Introduction

Analyse for antimikrobielle forbindelser i planter kræver separering af komponenter i en planteekstrakt, udsætter en test mikroorganisme disse komponenter, og bestemme, hvorvidt mikroorganismen vækst er hæmmet af nogen af ​​forbindelserne. Separationer af papir eller tyndtlagskromatografi (PC eller TLC) er praktisk, fordi mange forbindelser kan adskilles på en plan overflade. Adskillelse er baseret på polaritet, med nogle forbindelser binder tæt til adsorbent (cellulose, i tilfælde af PC, og en række adsorbenter i tilfælde af TLC) og overførslen mindre end andre 1. Figur 1 viser et eksempel på de relative positioner af polære og upolære phenolforbindelser efter separation på en silica-TLC-plade.

Figur 1
Figur 1. Diagram, der viser fordelingen af forbindelser med forskellige polariteter efter adskillelse på silicagel tyndtlagskromatografisk (TLC) plade. Phenolforbindelser af rødkløver (Trifolium pratense L.) anvendes som et eksempel. Polære forbindelser, såsom clovamide, har en stærk affinitet for en polær adsorbent som silica og forblive nær oprindelse (OR), mens mindre polære forbindelser, såsom de tre isoflavoner nær opløsningsmiddelfronten (SF), partition lettere i opløsningsmidler (som er mindre polære end silica medmindre vand, syrer eller baser er inkluderet) og migrere længere op pladen.

Efter adskillelse af et uddrag på en TLC-plade, kan forsøgsmikroorganismer blive udsat for alle forbindelser på pladen, og dermed fremskynde identifikation af de aktive komponenter i en ekstrakt 2. Hvis en svampe-eller bakteriel kultur udsættes for kromatogrammet, vil mikrobiel vækst forekomme overalt, undtagen i områder med vækst-inhibitory forbindelser. Hæmningszoner så kan visualiseres ved at observere kontrasten mellem mycelievækst og den vækst-fri områder, hvis svampe er blevet anvendt 3 eller ved sprøjtning med forbindelser, der skifter farve når det reduceres eller hydrolyseret af levende celler 4.. Selv om brugen af papir eller tyndtlagschromatogrammer for antimikrobielle assays først blev anvendt antibiotika 5 og fungicider 3,6, er planteekstrakter nu ofte screenes for antimikrobielle stoffer med denne metode, der ofte omtales som bioautografi. De beskrevne protokoller heri gælder bioautografi af tyndtlagschromatogrammer. TLC er almindeligt anvendt, fordi det er relativt hurtig og kan udføres på forskellige adsorbenter (fx silica, stivelse, alumina), såvel som giver god opløsning og følsomhed 1.

Planteekstrakter kan fremstilles til TLC på mange måder. Almindelige metoder er bl.a. udvinder plantemateriale alcohol-vand-blandinger, såsom 80% ethanol 7,8, eventuelt med tilsætning af syre eller base 9. Efter ekstraktion i sådanne opløsningsmidler, som indeholder noget vand, og som muligvis er sur eller basisk, skal ekstrakter koncentreres, så de kan anvendes til TLC-plader i et minimalt volumen. Koncentrationen af vand og alkohol ekstrakter kan opnås ved at opdele med vand ikke-blandbare organiske opløsningsmidler 8 eller med en blanding af sådanne opløsningsmidler, såsom ethylacetat-ethylether (1:1, v / v) 10,11. Forskellige plantemetabolitter udvindes i forskellige organiske opløsningsmidler, afhængigt af deres polaritet. For at sikre at plante organiske syrer eller baser er ekstraheret i organiske opløsningsmidler på dette stadium, kan pH af en alkohol-vand-ekstrakt hæves eller sænkes med en vandopløselig syre eller base til at konvertere dissocierede analytter i deres nondissociated former, som derefter opløseligt i neutralt organiske opløsningsmidler 9. Den organiske fase kan derefter evaporated under reduceret tryk eller under nitrogen og justeres til det ønskede volumen til TLC. PH af ekstrakten er usandsynligt, at være dødelige for bioassaydata mikroorganismer på grund af opdelingen af ​​analytter i neutrale opløsningsmidler, lille afsluttende volumen og fordampning af ekstrakten på TLC-pladen forud for separation.

Både svampe og bakterier er ansat som test-mikroorganismer i bioautografi af planteekstrakter 2. Sporer af visse svampe, såsom Cladosporium cucumerinum spire på TLC-plader (bortset fra områder med inhiberende forbindelser), hvis sprøjtes på pladerne i en næringsopløsning og inkuberet i et fugtigt miljø i flere dage 3. Den mørke mycelium C. cucumerinum på inhiberende zoner giver en skarp kontrast til zoner gratis mycelievækst. Selvom bakterier er blevet anvendt til tyndtlagskromatografi (TLC) plader på samme måde 4,12, bakterier er også hældes over TLCplade overflader i agar overlejrer 13,14. Gær, såsom Candida albicans, kan anvendes i agar overlejringer samt 14. Alternativt kan TLC-plader placeres med forsiden nedad på agar podet med bakterier 10,15 eller gær 8, en metode, der kaldes kontakt bioautografi 2.

Vi beskriver en metode til kontakt bioautografi at screene for antimikrobielle phenolforbindelser fra rødkløver (Trifolium pratense cv. Kenland). Testen mikroorganisme Clostridium sticklandii en ruminal hyper ammoniak-producerende bakterie (HAB) og obligate anaerobe. Selv om separationer anvendte ikke løser alle komponenter i ekstraktet, de lette identifikationen af ​​zoner antimikrobiel aktivitet, og dermed indsnævre puljen af ​​mulige antimikrobielle forbindelser. Protokollen anvender standardprocedurer for TLC 1.. Protokollen beskriver også nogle af de teknikker, der kræves til dyrkning forpligtelsergate anaerobe til en sådan analyse, en brug af kontakt bioautografi 15 og en visualisering metode med et tetrazoliumsalt, der farver levende celler 2,4.

Protocol

1.. Udarbejdelse af planteekstrakt Se Kagan og Flythe 10 for udvinding af phenolforbindelser fra Trifolium pratense cv. Kenland. At udtrække andre forbindelser i andre planter, så tjek den fytokemiske analyse litteratur for plante-eller metabolit-specifikke udvindingsmetoder (mange er beskrevet), eller kigge efter protokoller såsom dem Khurram et al. 7,8, som isolerer mange forbindelser med en bred udvalg af polariteter. 2. …

Representative Results

Repræsentative silica TLC separationer af rødkløver (Trifolium pratense cv. Kenland) ekstrakter, der indeholder phenolforbindelser, er vist i figur 2.. Adskillelse af rødkløverekstrakt i ethylacetat-hexan (9:1, v / v), mere end 8,5 cm, resulterede i fem bånd, et ufuldstændigt løst fra oprindelsen (figur 2A). Figur 2B viser imidlertid, at omkring dobbelt så mange bands blev afsløret, da en anden prøve af rødkløver ekstrakt (fra samme sort, men dyrket i et separat pl…

Discussion

Denne protokol beskriver en enkel fremgangsmåde til adskillelse af en ekstrakt i delmængder af forbindelser og analysere disse delmængder ved kontakt bioautografi. Metoden er meget lig brugt af Chomnawang et al. 15. at screene for plantemetabolitter hæmmende for gonoré-bakterier. Den type bioautografi ansat til skærmen for antimikrobielle plante forbindelser afhænger af mange faktorer, herunder test mikroorganisme, setup laboratorium og præferencer for den person (er) udfører bioassay. Konta…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker afdøde Dr. Norm Taylor, Afd Plant and Soil Science på University of Kentucky, for at tillade os at bruge prøver fra hans røde kløver grunde til denne undersøgelse. Dette projekt blev finansieret af United States Department of Agriculture.

Materials

Silica F254 TLC plates, aluminum-backed, 0.2 mm thickness, 20 × 20 cm EMD Chemicals  5554/7 These plates are coated with silica that contains an indicator fluorescing at 254 nm.  Compounds absorbing at that wavelength appear dark on a fluorescent green background.  Alternative sources include Analtech, Selecto Scientific, Fluka.  Adsorbents other than silica may be needed.  Plastic-backed plates may be suitable, depending on the solvents to be used.  
Sharp, heavy-duty scissors  any sewing supply company similar to Fiskars  175800-1002 For cutting TLC plates.  A paper cutter with a sharp blade can be used as well.  Do not inhale silica dust.
Drying oven at 100 °C (mechanical convection) Thermo Scientific PR305225M Quincy Lab, Inc, Chicago, IL (www.quincylab.com); Cascade Technical Sciences, Hillsboro, OR (www.cascadetek.com)
TLC chamber Kimble Chase  416180-0000 Alternative sources:  Aldrich. Pyrex beakers or preserving jars can be used for small plates (i.e. 5 × 10 cm).  Cover with aluminum foil (jar lids may contain material extractable by solvent vapors).
50-µL syringe with flat needle tip Hamilton 80965 For loading amounts of standard or sample exceeding 5-10 µL.  Alternative sources are equivalent.
micropipets Drummond 2-000-001 For loading small amounts of standards or samples.  Alternative sources:  VWR.  Also, Pasteur pipets can be stretched to a thinner diameter with a butane torch.  
Filter paper (#1 grade) Whatman 1001 917 Serves as a chamber wick.  Other grades of filter paper are OK.  This size can be trimmed for the chambers holding 20 × 20 cm plates.    
Beaker tongs Fisher Scientific 15-186 For putting plates in and out of a large TLC chamber.  Alternate sources: VWR 
Flat-edge forceps  Fisher Scientific 10-275 For putting plates in and out of a small chamber.   Alternate sources: VWR 
Small portable UV lamp with 4-Watt or 6-Watt bulbs for short- and long-wave UV light illumination (254 and 365 nm, respectively) Ultraviolet Products  95-0271-01 Alternate sources: Spectronics Corporation (www.spectroline.net)
Viewing cabinet for use with hand-held UV lamp Ultraviolet Products  Chromato-Vue C-10E UV-active bands are more easily circled if plates can be set in here.  Alternate sources: Spectronics Corporation. 
Photodocumentation system with overhead UV lamp and visible lamp Kodak  Gel Logic 200  Alternate sources: Ultraviolet Products (www.uvp.com).  See protocol for homemade alternative.
Anaerobic Chamber, Type A, Vinyl Coy  7150000 This chamber is appropriate for anaerobic bacteria, like Clostridium sticklandii, as described.  However, growth conditions must be tailored to organism used in the assay.  A biosafety cabinet and other precautions should be taken if pathogenic organisms are used. Alternate sources: Anaerobe Systems, BioRad, Plas Labs, others 
Tetrazolium red Sigma-Aldrich T8877 Alternate sources: MP Biomedicals, Santa Cruz Biotechnology, Alfa Aesar
Ingredients for HAB media
Pyridoxamine · 2 HCl Sigma-Aldrich P9380 For this and for all the other reagents in this table, alternative sources are equivalent.
Riboflavin Sigma-Aldrich R4500
Thiamine HCl Sigma-Aldrich T3902
Nicotinamide Sigma-Aldrich N3376
Calcium D-Pantothenate Sigma-Aldrich C8731
Lipoic Acid  Sigma-Aldrich T5625
p-Aminobenzoic acid  Sigma-Aldrich A9878
Folic acid Sigma-Aldrich F8798
Biotin Sigma-Aldrich B4639
Cobalamine  Sigma-Aldrich C3607
Pyridoxal HCl Sigma-Aldrich P9130
Pyridoxine Sigma-Aldrich P5669
EDTA Sigma-Aldrich  E6758
Iron sulfate · 7 H2O Sigma-Aldrich  F8263
Zinc sulfate · 7 H2O Sigma-Aldrich Z0251
Manganese chloride · 4 H2O Sigma-Aldrich M8054
Boric acid Sigma-Aldrich B6768
Cobalt chloride · 6 H2O Sigma-Aldrich  C8661
Copper chloride · 2 H2O Sigma-Aldrich 459097
Nickel chloride · 6 H2O Sigma-Aldrich 203866
Sodium molybdate · 2 H2O Sigma-Aldrich 331058
 Trypticase (Pancreatic digest of casein) Thermo Fisher B11921
Potassium phosphate monobasic anhydrous Thermo Fisher P284
sodium carbonate · H2 Thermo Fisher S636
Agar Thermo Fisher 50841063
Magnesium sulfate · 6 H2O Thermo Fisher 7791-18-6
Calcium chloride · 2 H2O Thermo Fisher BP510
Cysteine HCl Thermo Fisher 19464780
Potassium phosphate dibasic anhydrous Thermo Fisher P290
Sodium chloride Thermo Fisher BP358

References

  1. Stahl, E., Ashworth, M. R. F. . Thin-layer chromatography. , (1969).
  2. Marston, A. Thin-layer chromatography with biological detection in phytochemistry. J. Chromatogr. A. 1218 (19), 2676-2683 .
  3. Homans, A. L., Fuchs, A. Direct bioautography on thin-layer chromatograms as a method for detecting fungitoxic substances. J. Chromatogr. 51, 327-329 .
  4. Lund, B. M., Lyon, G. D. Detection of inhibitors of Erwinia carotovora and E. herbicola on thin-layer chromatograms. J. Chromatogr. 110, 193-196 (1975).
  5. Betina, V. Bioautography in paper and thin-layer chromatography and its scope in the antibiotic field. J. Chromatogr. A. 78, 41-51 (1973).
  6. Weltzien, H. C. Ein biologischer Test für fungizide Substanzen auf dem Papierchromatogramm. Naturwissenschaften. 45, 288-289 (1958).
  7. Khurram, M., Khan, A. M., Hameed, A., Abbas, N., Quayum, A., Inayat, H. Antibacterial activities of Dodonaea viscosa using contact bioautography technique. Molecules. 14 (3), 1332-1341 (2009).
  8. Khurram, M., et al. Evaluation of anticandidal potential of Quercus baloot Griff. using contact bioautography technique. Afr. J. Pharm. Pharmacol. 5 (12), 1538-1542 (2012).
  9. Robinson, T. . The Organic Constituents of Higher Plants. , (1963).
  10. Kagan, I. A., Flythe, M. D. Factors affecting the separation and bioactivity of red clover (Trifolium pratense) extracts assayed against Clostridium sticklandii, a ruminal hyper ammonia-producing bacterium. Nat. Prod. Commun. 7 (12), 1605-1608 (2012).
  11. Mattila, P., Kumpulainen, J. Determination of free and total phenolic acids in plant-derived foods by HPLC with diode-array detection. J. Agric. Food Chem. 50 (13), 3660-3667 (2002).
  12. Hamburger, M. O., Cordell, G. A. A direct bioautographic TLC assay for compounds possessing antibacterial activity. J. Nat. Prod. 50 (1), 19-22 (1987).
  13. Flythe, M., Kagan, I. Antimicrobial effect of red clover (Trifolium pratense) phenolic extract on the ruminal hyper ammonia-producing bacterium, Clostridium sticklandii. Curr. Microbiol. 61, 125-131 .
  14. Rahalison, L., Hamburger, M., Hostettmann, K., Monod, M., Frenk, E. A bioautographic agar overlay method for the detection of antifungal compounds from higher plants. Phytochem. Anal. 2 (5), 199-203 (1991).
  15. Chomnawang, M. T., Trinapakul, C., Gritsanapan, W. In vitro antigonococcal activity of Coscinium fenestratum stem extract. J. Ethnopharmacol. 122, 445-449 (2009).
  16. Stahl, E., Kaldewey, H. Spurenanalyse physiologisch aktiver, einfacher Indolderivate. Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem. 323, 182-191 .
  17. Kagan, I. A., Hammerschmidt, R. Arabidopsis ecotype variability in camalexin production and reaction to infection by Alternaria brassicicola. J. Chem. Ecol. 28 (11), 2121-2140 (2002).
  18. Kline, R. M., Golab, T. A simple technique in developing thin-layer bioautographs. J. Chromatogr. 18, 409-411 (1965).
  19. Wedge, D. E., Nagle, D. G. A new 2D-TLC bioautography method for the discovery of novel antifungal agents to control plant pathogens. J. Nat. Prod. 63 (8), 1050-1054 (2000).
  20. Beck, A. B., Knox, J. R. The acylated isoflavone glycosides from subterranean clover and red clover. Aust. J. Chem. 24 (7), 1509-1518 (1971).
  21. Kahn, R. A., Bak, S., Svendsen, I., Halkier, B. A., Møller, B. L. Isolation and reconstitution of cytochrome P450ox and in vitro reconstitution of the entire biosynthetic pathway of the cyanogenic glucoside dhurrin from sorghum. Plant Physiol. 115 (4), (1997).
  22. Peterson, C. A., Edgington, L. V. Quantitative estimation of the fungicide benomyl using a bioautograph technique. J. Agr. Food Chem. 17 (4), 898-899 (1969).
check_url/51411?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Kagan, I. A., Flythe, M. D. Thin-layer Chromatographic (TLC) Separations and Bioassays of Plant Extracts to Identify Antimicrobial Compounds. J. Vis. Exp. (85), e51411, doi:10.3791/51411 (2014).

View Video