qPCR est une méthode sensible et rapide pour la détection de l'ADN cytomégalovirus dans la formaline fixe, inclus dans la paraffine des tissus de biopsie
Summary
This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.
Abstract
Il est essentiel d'identifier le cytomégalovirus (CMV) dans le tractus gastro-intestinal (GI) chez les patients immunodéprimés, compte tenu de leur plus grand risque de développer une infection grave. Beaucoup de méthodes de laboratoire pour la détection de l'infection à CMV ont été développés, notamment la sérologie, culture virale, et des méthodes moléculaires. Souvent, ces méthodes reflètent une atteinte systémique par le CMV et ne permettent pas d'identifier précisément l'implication du tissu local. Par conséquent, la détection de l'infection par le CMV dans le tractus gastro-intestinal est souvent fait en histologie classique de tissu de biopsie. Hématoxyline et l'éosine (H & E) coloration en conjonction avec l'immunohistochimie (IHC) sont restés les piliers de l'examen de ces biopsies. H & E et IHC entraînent parfois des atypiques (équivoques) motifs de coloration, ce qui rend l'interprétation difficile. Il a été montré que la polymerase chain reaction quantitative (qPCR) pour le CMV peut être exécutée avec succès sur, les tissus de biopsie inclus dans la paraffine (FFPE) fixés au formol pour les trèshaute sensibilité et spécificité. L'objectif de ce protocole est de démontrer comment effectuer les essais qPCR pour la détection du CMV dans FFPE tissu de biopsie dans un laboratoire clinique. Cette méthode est susceptible d'être d'une grande utilité pour les patients en cas de coloration équivoque pour le CMV dans des biopsies de GI.
Introduction
Interprétation du cytomégalovirus (CMV) dans les échantillons cliniques est très important. Le CMV est un membre de la sous-famille des herpesvirus Betaherpesvirinae. Semblable à d'autres virus de l'herpès, le CMV a la capacité d'établir une infection persistante ou latente caractérisé par un manque de réplication virale active 1. Réactivation du virus peut se produire pendant les périodes de stress ou autre immunosuppression, conduisant à une réplication virale active caractérisée par virion de presse, qui peut être accompagné par des manifestations de la maladie 2-4. Gastro-intestinal (GI) symptômes de la maladie à CMV comprennent souvent des douleurs abdominales et / ou des selles sanglantes 1.
Le diagnostic de la gastro-entérite à CMV par histologie utilise de l'hématoxyline et de l'éosine (H & E) pour identifier CMV inclusions virales. Dans les cas où la suspicion clinique est forte pour l'instant aucun inclusions évidentes sont observées, l'immunohistochimie (IHC) est fréquemment utilisé comme une méthode de test complémentaire. Cependant, IHCpeut également être entravée par apparaissant motifs de coloration cellulaire non-classiques rares (équivoques), ce qui rend l'interprétation difficile (figure 2) 5. Il a cherché à utiliser l'ADN extrait d'fixés au formol, inclus en paraffine (FFPE) tissu GI de biopsie et quantitative en chaîne par polymérase (qPCR) pour détecter le CMV dans des biopsies de GI. Cette technique s'est révélée être utile dans la détection de CMV dans des biopsies de GI, et est particulièrement utile dans les cas ambigus de coloration IHC 5,6. En outre, qPCR a également été montré une bonne corrélation avec les données de test de CMV clinique supplémentaire quand il est disponible 6. L'utilisation de qPCR dans la détection de CMV peut conduire à un diagnostic plus précoce et le traitement dans les cas où la suspicion clinique pour le CMV est élevé, mais H & E et le CMV IHC sont négatifs.
Protocol
Representative Results
Discussion
De nombreux procédés de laboratoire sont disponibles pour le diagnostic de cytomégalovirus (CMV), y compris la sérologie, la culture virale, les dosages de virémie moléculaires, l'histologie de matériel de biopsie, et, comme démontré récemment, des dosages moléculaires fixés à la formaline, inclus en paraffine (FFPE) biopsie 5,6 tissulaire. Sérologie, une fois l'un des piliers de diagnostic, identifie seulement de manière fiable l'exposition et ne correspond pas bien avec l'infe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous reconnaissons Amy Thomasson pour son aide à la préparation de ce manuscrit, et Fredrik Skarstedt et Ryan Christy pour leurs efforts dans la préparation de chiffres.
Materials
| 1.7 mL microfuge tubes | Costar | 3620 | |
| serrated forceps | Electron Microscopy Services | 62086-1S | Micro Forceps MF-1 |
| Tabletop centrifuges (microfuge) | Eppendorf | 5424 | |
| Xylene | Fisher | Fisher Scientific: X3P | 1 gallon |
| Ethanol | Fisher | Fisher Scientific: ET108 | 96-100% |
| microtome | Leica | RM2255 | |
| QIAamp DNA FFPE Tissue Kit | Qiagen | 56404 | |
| artus CMV LightCycler PCR ASR | Qiagen | 4500025 | |
| CMV LC PCR Supplement Kit | Qiagen | 1031873 | |
| LightCycler centrifuge | Roche | 75005087 | |
| LightCycler Cooling Block | Roche | 10800058001 | |
| LightCycler Capping Tool | Roche | 3357317 | |
| Color Compensation Kit | Roche | 2158850 | |
| LightCycler 20 μL Capillaries | Roche | 1 909 339 | |
| blades | Sakura | Fisher Scientific: 4689 | Accu-Edge low profile |
References
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