qPCR é um método sensível e rápido para detecção de DNA por citomegalovírus em formalina-fixo, tecido da biópsia de parafina-embedded
Summary
This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.
Abstract
É crucial para identificar a infecção por citomegalovírus (CMV) no trato gastrointestinal (TGI) de pacientes imunossuprimidos, dada a sua maior risco de desenvolver infecção grave. Muitos métodos laboratoriais para a detecção de infecção por CMV têm sido desenvolvidos, incluindo sorologia, a cultura viral, e métodos moleculares. Muitas vezes, esses métodos refletem o acometimento sistêmico com CMV e não identificam especificamente o envolvimento do tecido local. Portanto, a detecção de infecção por CMV no tracto GI é frequentemente feito por histologia tradicional de tecidos de biopsia. Hematoxilina e eosina (H & E) em conjunto com a coloração imuno-histoquímica (IHQ) mantiveram-se os principais pilares de examinar essas biópsias. H & E e IHC, por vezes, resultar em atípicos (ambíguos) padrões de coloração, tornando difícil interpretação. Foi mostrado que a polimerase de reacção em cadeia quantitativa (qPCR) por CMV pode ser realizada com sucesso em, tecidos de biopsia (FFPE) em parafina e fixado em formalina para muitoalta sensibilidade e especificidade. O objetivo deste protocolo é para demonstrar como realizar testes de qPCR para a detecção de CMV no tecido biópsia FFPE em um ambiente de laboratório clínico. Este método é susceptível de ser de grande benefício para o paciente, em caso de coloração equívoca para CMV em biópsias GI.
Introduction
Interpretação da infecção por citomegalovírus (CMV) em amostras clínicas é criticamente importante. O CMV é um membro da subfamília Betaherpesvirinae de herpesvírus. Semelhante a outros vírus de herpes, CMV tem a capacidade de estabelecer infecção persistente ou latente caracterizada por uma falta de replicação viral activa 1. A reativação do vírus pode ocorrer durante momentos de estresse ou outra imunossupressão, levando a replicação viral activa caracterizada pela liberação virion, que pode ser acompanhada de manifestações da doença 2-4. Gastrointestinal (GI) os sintomas da doença CMV freqüentemente incluem dor abdominal e / ou fezes com sangue um.
O diagnóstico de CMV gastroenterite por histologia utiliza hematoxilina e eosina (H & E) para identificar CMV inclusões virais. Nos casos em que a suspeita clínica é alta ainda são observados sem inclusões óbvias, imuno-histoquímica (IHQ) é freqüentemente usado como um método de ensaio adjunto. No entanto, IHCtambém pode ser prejudicada pela não-clássicas surgem padrões raros de coloração celular (duvidosos), tornando difícil interpretação (Figura 2) 5. Buscou-se utilizar DNA extraído de fixados em formalina e incluído em parafina (FFPE) tecidos de biópsia GI e reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) para detectar CMV em biópsias IG. Esta técnica tem mostrado ser útil na detecção de CMV em biópsias GI, e é particularmente útil em casos duvidosos IHC coloração 5,6. Além disso, qPCR também tem sido demonstrado que se correlacionam bem com os dados de teste de CMV clínica adicional, quando ele está disponível 6. Uso de qPCR na detecção de CMV pode levar a um diagnóstico precoce e tratamento nos casos em que a suspeita clínica para CMV é alta, mas H & E e CMV IHC são negativos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Muitos métodos laboratoriais estão disponíveis para o diagnóstico da infecção pelo citomegalovírus (CMV), incluindo sorologia, cultura viral, ensaios moleculares de viremia, histologia do material da biópsia e, como demonstrado recentemente, ensaios moleculares de, a biópsia fixadas em formalina embebido em parafina (FFPE) 5,6 tecido. Sorologia, uma vez que um dos pilares do diagnóstico, identifica apenas confiável exposição e não se correlaciona bem com a infecção por CMV aguda 7. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconhecemos Amy Thomasson por sua assistência com a preparação deste manuscrito, e Fredrik Skarstedt e Ryan Christy por seus esforços na preparação das figuras.
Materials
| 1.7 mL microfuge tubes | Costar | 3620 | |
| serrated forceps | Electron Microscopy Services | 62086-1S | Micro Forceps MF-1 |
| Tabletop centrifuges (microfuge) | Eppendorf | 5424 | |
| Xylene | Fisher | Fisher Scientific: X3P | 1 gallon |
| Ethanol | Fisher | Fisher Scientific: ET108 | 96-100% |
| microtome | Leica | RM2255 | |
| QIAamp DNA FFPE Tissue Kit | Qiagen | 56404 | |
| artus CMV LightCycler PCR ASR | Qiagen | 4500025 | |
| CMV LC PCR Supplement Kit | Qiagen | 1031873 | |
| LightCycler centrifuge | Roche | 75005087 | |
| LightCycler Cooling Block | Roche | 10800058001 | |
| LightCycler Capping Tool | Roche | 3357317 | |
| Color Compensation Kit | Roche | 2158850 | |
| LightCycler 20 μL Capillaries | Roche | 1 909 339 | |
| blades | Sakura | Fisher Scientific: 4689 | Accu-Edge low profile |
References
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