qPCR es un método sensible y rápido para la detección de ADN de citomegalovirus en fija en formol, biopsia de tejido embebido en parafina
Summary
This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.
Abstract
Es crucial para identificar la infección por citomegalovirus (CMV) en el tracto gastrointestinal (GI) de los pacientes inmunodeprimidos, dado su mayor riesgo de desarrollar una infección grave. Muchos métodos de laboratorio para la detección de la infección por CMV se han desarrollado, incluyendo serología, el cultivo viral y métodos moleculares. A menudo, estos métodos reflejan afectación sistémica por CMV y no identifican específicamente la participación del tejido local. Por lo tanto, la detección de la infección por CMV en el tracto gastrointestinal se realiza con frecuencia por la histología tradicional de tejido de la biopsia. La tinción con hematoxilina y eosina (H & E) en conjunción con técnicas de inmunohistoquímica (IHC) se han mantenido los pilares de examinar estas biopsias. H & E e IHC veces resultan en (dudosos) patrones de tinción atípicos, lo que hace difícil la interpretación. Se demostró que la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) para CMV con éxito se puede realizar en fijado en formol, tejido de biopsia incrustado en parafina (FFPE) de muyalta sensibilidad y especificidad. El objetivo de este protocolo es demostrar cómo llevar a cabo las pruebas de qPCR para la detección de CMV en tejido de biopsia FFPE en un laboratorio clínico. Este método es probable que sea de gran beneficio para los pacientes en los casos de la aparición de manchas por CMV en biopsias GI.
Introduction
Interpretación de la infección por citomegalovirus (CMV) en muestras clínicas es críticamente importante. CMV es un miembro de la subfamilia Betaherpesvirinae de herpesvirus. Al igual que otros virus de herpes, CMV tiene la capacidad de establecer una infección persistente o latente que se caracteriza por una falta de replicación viral activa 1. La reactivación del virus puede producirse en momentos de estrés o de otro tipo de inmunosupresión, lo que lleva a la replicación viral activa caracterizada por la liberación de viriones, que puede estar acompañado de manifestaciones de la enfermedad 2-4. Gastrointestinal (GI) los síntomas de la enfermedad por CMV con frecuencia incluyen dolor abdominal y / o heces con sangre 1.
El diagnóstico de CMV gastroenteritis por histología utiliza hematoxilina y eosina (H & E) para identificar inclusiones virales de CMV. En los casos en que es alto pero no se observan inclusiones obvias sospecha clínica, inmunohistoquímica (IHC) se utiliza con frecuencia como un método de prueba adjunto. Sin embargo, IHCtambién puede verse obstaculizada por los patrones raros no aparecen clásicos de tinción celular (ambiguas), lo que hace difícil la interpretación (Figura 2) 5. Se trató de utilizar ADN extraído de fijado con formalina, embebido en parafina (FFPE) tejido de la biopsia GI y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) para detectar CMV en biopsias GI. Esta técnica ha demostrado ser valiosa en la detección de CMV en biopsias GI, y es particularmente útil en los casos de tinción IHC equívocos 5,6. También, qPCR también se ha demostrado que se correlaciona bien con los datos de prueba de CMV clínico adicional cuando está disponible 6. El uso de qPCR para detectar CMV puede llevar a un diagnóstico precoz y el tratamiento en los casos en que la sospecha clínica para el CMV es alta, pero H & E y CMV IHC son negativos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Muchos métodos de laboratorio están disponibles para el diagnóstico de la infección por citomegalovirus (CMV), incluyendo serología, el cultivo viral, los ensayos moleculares de viremia, la histología de las biopsias, y, como se ha demostrado recientemente, ensayos moleculares de fijado en formol (FFPE) biopsia incluido en parafina 5,6 tejido. Serología, una vez a la base del diagnóstico, sólo identifica fiablemente la exposición y no se correlaciona bien con la infección aguda por citomegalovirus …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconocemos Amy Thomasson por su ayuda en la preparación de este manuscrito, y Fredrik Skarstedt y Ryan Christy por sus esfuerzos en la preparación de las figuras.
Materials
| 1.7 mL microfuge tubes | Costar | 3620 | |
| serrated forceps | Electron Microscopy Services | 62086-1S | Micro Forceps MF-1 |
| Tabletop centrifuges (microfuge) | Eppendorf | 5424 | |
| Xylene | Fisher | Fisher Scientific: X3P | 1 gallon |
| Ethanol | Fisher | Fisher Scientific: ET108 | 96-100% |
| microtome | Leica | RM2255 | |
| QIAamp DNA FFPE Tissue Kit | Qiagen | 56404 | |
| artus CMV LightCycler PCR ASR | Qiagen | 4500025 | |
| CMV LC PCR Supplement Kit | Qiagen | 1031873 | |
| LightCycler centrifuge | Roche | 75005087 | |
| LightCycler Cooling Block | Roche | 10800058001 | |
| LightCycler Capping Tool | Roche | 3357317 | |
| Color Compensation Kit | Roche | 2158850 | |
| LightCycler 20 μL Capillaries | Roche | 1 909 339 | |
| blades | Sakura | Fisher Scientific: 4689 | Accu-Edge low profile |
References
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