定量PCRは、ホルマリン固定、パラフィン包埋された生検組織中のサイトメガロウイルスDNAの検出のための高感度かつ迅速な方法であり、
Summary
This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.
Abstract
これは、重症感染症を開発するための彼らの大きなリスクを考えると、胃腸（GI）免疫抑制患者の管内でのサイトメガロウイルス（CMV）感染を識別することが重要です。 CMV感染の検出のための多くの実験室方法は、血清学、ウイルス培養、および分子の方法を含む、開発されている。多くの場合、これらの方法は、CMVによる全身の関与を反映し、特に局所的な組織の関与を特定していない。したがって、GI管におけるCMV感染の検出は、しばしば、生検組織の伝統的な組織学によって行われる。免疫組織化学（IHC）に連動して、ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）染色は、これらの生検を調べた柱が残っている。 H＆EおよびIHCは時々の解釈を困難にし、非定型（あいまい）染色パターンになる。これは、CMVの定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）が正常に非常にホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織生検を行うことができることが示された高い感度および特異性。このプロトコルの目的は、臨床検査の設定でのFFPE生検組織におけるCMVの検出のための定量PCRテストを実行する方法を示すことです。この方法は、GI生検におけるCMVのための曖昧な染色例の患者のために非常に有益である可能性が高い。
Introduction
臨床検体中のサイトメガロウイルス（CMV）感染の解釈は非常に重要である。 CMVはヘルペスウイルスのbetaherpesvirinaeサブファミリーのメンバーである。他のヘルペスウイルスと同様に、CMVはアクティブなウイルス複製1の欠如を特徴と持続性または潜伏感染を確立する能力を持っています。ウイルスの再活性化は、疾患の症状2-4を伴うことがあるビリオン放出を特徴と活発なウイルス複製につながる、ストレスや他の免疫抑制の時間帯に発生する可能性があります。胃腸（GI）のCMV疾患の症状が頻繁に腹痛および/ または血便1が含まれています。
組織学によるCMV胃腸炎の診断は、CMVウイルスの介在物を同定するためにヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）を利用する。臨床的疑いが高く、まだ明らかな介在物が観察されない場合において、免疫組織化学（IHC）は、しばしば補助試験法として使用される。しかし、IHCまた、解釈が難しい（ 図2）5作る珍しい非古典登場する携帯染色パターン（あいまい）によって妨げられることができる。なお、GI生検においてCMVを検出するために、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）GI生検組織および定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）から抽出したDNAを使用することが求められていた。この技術は、GI生検においてCMVの検出に貴重であることが示されており、曖昧なIHC染色ケース5,6において特に有用であるれている。また、定量PCRはまた、6利用可能になった追加のCMV臨床試験データとよく相関することが示されている。 CMVの検出に定量PCRの使用は、CMVのための臨床的疑いが高い場合での早期診断と治療につながる可能性がありますが、H＆EおよびCMV IHCは陰性である。
Protocol
Representative Results
Discussion
多くの実験室的方法は、最近実証されたように、血清学、ウイルス培養、分子ウイルス血アッセイ、生検材料の組織学、および、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）生検の分子アッセイを含む、サイトメガロウイルスの診断（CMV）感染にご利用いただけます組織5,6。血清学的検査は、診断の主力一度のみ確実に露出を識別し、急性CMV感染7とよく相関しない。ウイルス培養?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、図面の製造における彼らの努力のためにこの原稿を準備し、フレドリックSkarstedtとライアン·クリスティと彼女の援助のためエイミートマソンを認める。
Materials
| 1.7 mL microfuge tubes | Costar | 3620 | |
| serrated forceps | Electron Microscopy Services | 62086-1S | Micro Forceps MF-1 |
| Tabletop centrifuges (microfuge) | Eppendorf | 5424 | |
| Xylene | Fisher | Fisher Scientific: X3P | 1 gallon |
| Ethanol | Fisher | Fisher Scientific: ET108 | 96-100% |
| microtome | Leica | RM2255 | |
| QIAamp DNA FFPE Tissue Kit | Qiagen | 56404 | |
| artus CMV LightCycler PCR ASR | Qiagen | 4500025 | |
| CMV LC PCR Supplement Kit | Qiagen | 1031873 | |
| LightCycler centrifuge | Roche | 75005087 | |
| LightCycler Cooling Block | Roche | 10800058001 | |
| LightCycler Capping Tool | Roche | 3357317 | |
| Color Compensation Kit | Roche | 2158850 | |
| LightCycler 20 μL Capillaries | Roche | 1 909 339 | |
| blades | Sakura | Fisher Scientific: 4689 | Accu-Edge low profile |
References
- Hodinka, R. L. . Manual of Clnical Microbiology. 2, 1558-1574 (2011).
- Lasry, S., et al. Interstrain variations in the cytomegalovirus (CMV) glycoprotein B gene sequence among CMV-infected children attending six day care centers. The Journal of infectious diseases. 174, 606-609 (1996).
- Murph, J. R., Baron, J. C., Brown, C. K., Ebelhack, C. L., Bale Jr, J. F. The occupational risk of cytomegalovirus infection among day-care providers. JAMA : the journal of the American Medical Association. 265, 603-608 (1991).
- Pass, R. F., et al. Vaccine prevention of maternal cytomegalovirus infection. The New England journal of medicine. 360, 1191-1199 (2009).
- McCoy, M. H., et al. qPCR increases sensitivity to detect cytomegalovirus in paraffin-embedded, formalin-fixed tissue of gastrointestinal biopsies. Human Pathology. 45, 48-53 (2014).
- Mills, A. M., Guo, F. P., Copland, A. P., Pai, R. K., Pinsky, B. A. A comparison of CMV detection in gastrointestinal mucosal biopsies using immunohistochemistry and PCR performed on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. The American journal of surgical pathology. 37, 995-1000 (2013).
- Krech, U. Complement-fixing antibodies against cytomegalovirus in different parts of the world. Bulletin of the World Health Organization. 49, 103-106 (1973).
- Chou, S. Newer methods for diagnosis of cytomegalovirus infection. Reviews of infectious diseases. 12 Suppl 7, (1990).
- Brytting, M., Xu, W., Wahren, B., Sundqvist, V. A. Cytomegalovirus DNA detection in sera from patients with active cytomegalovirus infections. Journal of clinical microbiology. 30, 1937-1941 (1992).
- Revello, M. G., et al. Human cytomegalovirus in blood of immunocompetent persons during primary infection: prognostic implications for pregnancy. The Journal of infectious diseases. 177, 1170-1175 (1998).
- Shinkai, M., Bozzette, S. A., Powderly, W., Frame, P., Spector, S. A. Utility of urine and leukocyte cultures and plasma DNA polymerase chain reaction for identification of AIDS patients at risk for developing human cytomegalovirus disease. The Journal of infectious diseases. 175, 302-308 (1997).
