КПЦР является чувствительным и быстрый метод для обнаружения цитомегаловирусной ДНК в формалине фиксированной парафин биопсии ткани
Summary
This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.
Abstract
Очень важно определить цитомегаловирус (ЦМВ) инфекции в желудочно-кишечном тракта (ЖКТ) из пациентов с иммунодефицитом, учитывая их более высокий риск для развития тяжелой инфекции. Многие лабораторные методы для обнаружения ЦМВ-инфекции были разработаны, в том числе серологических, вирусной культуры и молекулярных методов. Часто эти методы отражают системный причастность к ЦМВ и не конкретно определить причастность местных тканей. Таким образом, обнаружение цитомегаловирусной инфекции в желудочно-кишечном тракте часто делается путем традиционного гистологии биопсии ткани. Гематоксилином и эозином (H & E) окрашивание в сочетании с иммуногистохимии (IHC) остались устои рассмотрении этих биопсии. Н & Е и IHC иногда привести к атипичных (двусмысленных) моделей окрашивания, делая интерпретация трудно. Было показано, что количественной полимеразной цепной реакции (КПЦР) для ЦМВ успешно может быть выполнена на фиксированных формалином, парафин (FFPE) биопсии ткани для оченьВысокая чувствительность и специфичность. Целью этого протокола является продемонстрировать, как выполнить тестирование КПЦР для обнаружения ЦМВ в FFPE биопсии ткани в клинических лабораторных условиях. Этот метод, вероятно, будет весьма полезным для пациентов в случаях двусмысленной окрашивания для ЦМВ в GI биопсии.
Introduction
Интерпретация цитомегаловирус (ЦМВ) инфекции в клинических образцах является критически важным. ЦМВ является членом Betaherpesvirinae подсемейства герпесвирусов. Как и в других герпесвирусов, ЦМВ имеет возможность установить постоянный или латентной инфекции характеризуется отсутствием активной репликации вируса 1. Повторная активация вируса может произойти во время стресса или другого иммуносупрессии, что приводит к активной репликации вируса характеризуется вириона релиза, который могут сопровождать проявлений болезни 2-4. Желудочно-кишечные (GI) симптомы ЦМВ заболевания часто включают боль в животе и / или Кровавый стул 1.
Диагноз ЦМВ гастроэнтерита по гистологии использует гематоксилином и эозином (H & E) для выявления ЦМВ вирусных включений. В случаях, когда не высокая, но наблюдаются никаких очевидных включений клиническое подозрение, иммуногистохимия (IHC) часто используется в качестве адъюнкт-метода испытания. Тем не менее, IHCтакже может быть затруднено редких неклассических появляющихся моделей сотовых окрашивания (двусмысленных), что делает толкование трудно (рис. 2) 5. Было стремились использовать ДНК, выделенной из фиксированных формалином, парафин (FFPE) Г.И. биопсии ткани и количественной полимеразной цепной реакции (КПЦР) для обнаружения ЦМВ в GI биопсии. Эта техника была показано, что ценно в обнаружении ЦМВ в GI биопсии, и особенно полезно в двусмысленных IHC окрашивания случаях 5,6. Кроме того, КПЦР Также было показано, хорошо коррелирует с клинической дополнительной тестовых данных CMV, когда это доступно 6. Использование кПЦР в обнаружении ЦМВ может привести к ранней диагностике и лечения в тех случаях, когда клинические признаки ЦМВ является высокой, но H & E и ЦМВ IHC отрицательны.
Protocol
Representative Results
Discussion
Многие лабораторные методы доступны для диагностики цитомегаловируса (ЦМВ) инфекции, в том числе серологических, вирусной культуры, молекулярных анализов виремии, гистологии материале биопсии, и, как недавно продемонстрировали, молекулярных анализов фиксированные формалином, парафи…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы признаем, Эми Томассон за помощь с подготовкой эту рукопись, и Фредрик Скарстедт и Райан Кристи за их усилия по подготовке фигур.
Materials
| 1.7 mL microfuge tubes | Costar | 3620 | |
| serrated forceps | Electron Microscopy Services | 62086-1S | Micro Forceps MF-1 |
| Tabletop centrifuges (microfuge) | Eppendorf | 5424 | |
| Xylene | Fisher | Fisher Scientific: X3P | 1 gallon |
| Ethanol | Fisher | Fisher Scientific: ET108 | 96-100% |
| microtome | Leica | RM2255 | |
| QIAamp DNA FFPE Tissue Kit | Qiagen | 56404 | |
| artus CMV LightCycler PCR ASR | Qiagen | 4500025 | |
| CMV LC PCR Supplement Kit | Qiagen | 1031873 | |
| LightCycler centrifuge | Roche | 75005087 | |
| LightCycler Cooling Block | Roche | 10800058001 | |
| LightCycler Capping Tool | Roche | 3357317 | |
| Color Compensation Kit | Roche | 2158850 | |
| LightCycler 20 μL Capillaries | Roche | 1 909 339 | |
| blades | Sakura | Fisher Scientific: 4689 | Accu-Edge low profile |
References
- Hodinka, R. L. . Manual of Clnical Microbiology. 2, 1558-1574 (2011).
- Lasry, S., et al. Interstrain variations in the cytomegalovirus (CMV) glycoprotein B gene sequence among CMV-infected children attending six day care centers. The Journal of infectious diseases. 174, 606-609 (1996).
- Murph, J. R., Baron, J. C., Brown, C. K., Ebelhack, C. L., Bale Jr, J. F. The occupational risk of cytomegalovirus infection among day-care providers. JAMA : the journal of the American Medical Association. 265, 603-608 (1991).
- Pass, R. F., et al. Vaccine prevention of maternal cytomegalovirus infection. The New England journal of medicine. 360, 1191-1199 (2009).
- McCoy, M. H., et al. qPCR increases sensitivity to detect cytomegalovirus in paraffin-embedded, formalin-fixed tissue of gastrointestinal biopsies. Human Pathology. 45, 48-53 (2014).
- Mills, A. M., Guo, F. P., Copland, A. P., Pai, R. K., Pinsky, B. A. A comparison of CMV detection in gastrointestinal mucosal biopsies using immunohistochemistry and PCR performed on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. The American journal of surgical pathology. 37, 995-1000 (2013).
- Krech, U. Complement-fixing antibodies against cytomegalovirus in different parts of the world. Bulletin of the World Health Organization. 49, 103-106 (1973).
- Chou, S. Newer methods for diagnosis of cytomegalovirus infection. Reviews of infectious diseases. 12 Suppl 7, (1990).
- Brytting, M., Xu, W., Wahren, B., Sundqvist, V. A. Cytomegalovirus DNA detection in sera from patients with active cytomegalovirus infections. Journal of clinical microbiology. 30, 1937-1941 (1992).
- Revello, M. G., et al. Human cytomegalovirus in blood of immunocompetent persons during primary infection: prognostic implications for pregnancy. The Journal of infectious diseases. 177, 1170-1175 (1998).
- Shinkai, M., Bozzette, S. A., Powderly, W., Frame, P., Spector, S. A. Utility of urine and leukocyte cultures and plasma DNA polymerase chain reaction for identification of AIDS patients at risk for developing human cytomegalovirus disease. The Journal of infectious diseases. 175, 302-308 (1997).
