利用siRNA筛选鉴定培养哺乳动物细胞中生物学通路的泛素及泛素样系统调控因子

摘要

本文介绍了一种靶向siRNA“泛素组”筛选方法，用于鉴定介导HIF1A低氧细胞反应的新型泛素及类泛素调控因子。  该方法可适用于任何具有可靠报告基因活性读数的生物学通路。

摘要

蛋白质与泛素及泛素样分子（UBLs）之间的翻译后修饰正逐渐成为一个动态的细胞信号转导网络，调控多种生物学通路，包括缺氧反应、蛋白质稳态、DNA损伤应答以及转录过程。  为了更深入地理解UBLs如何调控与人类疾病相关的通路，我们构建了一个包含1,186个siRNA双链池的人源siRNA“泛素组”文库，靶向所有已知和预测的UBL系统通路组分。该文库可用于多种表达不同生物学通路报告基因的细胞系进行筛选，以确定哪些UBL组分作为特定通路的正向或负向调控因子。  本文中，我们描述了一种利用该文库筛选HIF1A介导的缺氧细胞应答中泛素组调控因子的实验方案，采用基于转录的荧光素酶报告系统。  在正式筛选前，需首先进行初步的实验优化，以确立适合该细胞系的筛选参数，随后分三个阶段进行筛选：初筛、复筛和三筛/去卷积筛选。  相较于全基因组siRNA文库，靶向性siRNA文库的应用正日益广泛，其优势在于仅报告研究者最关注通路中的相关成员。  尽管siRNA筛选存在固有局限性，特别是由siRNA脱靶效应引起的假阳性结果，但通过一系列严谨设计的对照实验，仍可有效识别出真正的新调控因子，从而克服这些不足。

引言

蛋白质与泛素及泛素样分子（UBLs）的修饰构成一个广泛的生物化学系统，可调控多种生物学通路和应激反应。 UBLs 共价连接到靶蛋白后可产生多种结果，调节底物的稳定性、定位、功能或相互作用组¹。 UBL 修饰的酶促反应步骤最初在泛素中被确立，现已成为大多数 UBLs（包括 SUMO、NEDD8、ISG15 和 FAT10）修饰的范式。 修饰发生时，首先由 E1 激活酶激活 UBL 双甘氨酸基序的羧基，形成高能硫醇中间体，随后转移至 E2 结合酶活性位点的半胱氨酸上。 然后，E2 与结合底物的 E3 连接酶相互作用，介导 UBL 转移至（通常为）靶向赖氨酸残基，形成支链（异肽键）连接²。 可进行多轮连续修饰，在底物上构建异肽链；对于泛素而言，可通过其七个赖氨酸中的任意一个，或通过其N端甲硫氨酸形成线性泛素链。 这些修饰形成具有不同功能的特定拓扑结构，例如产生新的相互作用基序，或在特异性蛋白酶切除 UBL 之前将蛋白质靶向降解。 以泛素为例，存在两种 E1 酶、30–40 种 E2 结合酶、至少 600 种 E3 连接酶以及约 100 种去泛素化酶（DUBs）。 尽管其他约 10 种 UBLs 的通路相对简单，但整体泛素化系统的复杂性赋予了特定 UBL 修饰在生物学效应上的巨大多样性。 然而，尽管 UBL 生物学已取得重大进展，这些泛素化组分中大多数在细胞内的确切功能仍不清楚。

方案

1. 检测开发阶段

注意：在启动siRNA筛选之前，必须进行检测方法开发阶段，以确定使用报告细胞系进行筛选的重要参数。此阶段需要投入大量精力，因为这将为后续筛选的成功奠定基础。

1. 为表征U20S-HRE报告细胞系对缺氧的响应性，接种2 x 75 cm²培养瓶² 在添加了10% FBS的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，将U20S-HRE细胞培养至80-90%汇合度。
2. 从一个细胞培养瓶中吸除培养基，用 10 ml PBS 洗涤两次，加入 2 ml 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液消化细胞，并于 37 °C 5 分钟后，将细胞重悬于 8 ml DMEM 10% FBS 中，并反复吹打以形成均匀的细胞悬液。
3. 移液器 20 μl 将悬液取等量两份加入细胞计数室，插入自动细胞计数仪中。在细胞计数仪软件中点击“显示图像”，确保细胞处于对焦状态。点击“计数”，记录细胞密度。对另一份重复样进行相同操作，并计算平均细胞密度。用含10%胎牛血清的DMEM将细胞稀释至浓度为60,000个细胞/ml。
4. 使用多通道移液器，加入 100 μl (6,000 个细胞) 稀释后的细胞加入相同的三列中例如 A5-H5、A6-H6 和 A7-H7）的 5 块无菌白色壁 96 孔检测板中，并转移至湿润的 37 °C 5% CO₂ 培养箱₂ 过夜。注意：这些培养板....

结果

在开始筛选之前，需先确定 U20S-HRE 细胞对缺氧的响应性。U20S-HRE 细胞表达一种报告基因构建体，该构建体包含三个串联的缺氧反应元件（HRE）下游融合的萤火虫荧光素酶基因，当细胞处于缺氧环境时，HIF1A/HIF1B 异源二聚体可结合于该元件（图 1A）。将细胞置于缺氧工作站中处理不同时间，以确定最适合筛选的缺氧暴露时长。U20S 细胞中 HIF2A 表达水平较低，因此荧光素酶信号主要依赖于缺氧介导的 HIF1A 稳定化⁷。U20S-HRE 细胞在缺氧条件下分别暴露 0 小时、2 小时、4 小时、6 小时和 24 小时后，荧光素酶活性呈现缺氧依赖性的诱导升高（图 1B）。其中，缺氧暴露 24 小时可诱导活性升高约 10 倍（图 1B），因此该条件适用于 siRNA 筛选。

为建立合适的高值和低值对照，使用针对 HIF1A 和 FIH1 的 siRNA 对 U20S-HRE 细胞进行反向转染。细胞转染对照 24 小时后，再暴露于低氧环境 24 小时，.......

讨论

在哺乳动物细胞中进行全基因组范围的siRNA筛选已被证明在鉴定特定生物通路的新型调控因子方面具有极高的价值。本文中，我们描述了利用靶向泛素化相关基因的siRNA筛选方法，以鉴定介导HIF1A在缺氧条件下细胞应答的调控因子。  靶向筛选正变得越来越有吸引力，因为这类筛选通常成本更低、耗时更短、易于管理，并且仅报告研究者感兴趣的通路组分 ^{7, 10, 11}。

在检测方法开发阶段必须投入大量工作，以确保基础细胞报告系统适用于筛选，并能够实现良好的重复性和低变异性。  同时，选择稳健的阳性和阴性对照也至关重要，以便建立一个清晰的信号窗口，使文库中的调控因子能够落入该范围内。  此外，这些对照可在每次筛选的每块检测板中作为内部对照，有助于快速识别单个检测板可能出现的任何问题。 

高通量筛选中一个常见问题是边缘效应，这可能是由于培养板外周孔与内部孔之间局部湿度差异所导致。  设置适当的对照并绘制培养板结果的热图有助于识别这一问题。  我们发现，通过在培养板底.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
自动化液体分配器	Fluid-X	XPP-721	http://www.fluidx.eu/BIOTRACK/xpp-721-liquid-handling-system.html
白色壁板检测板	Greiner Bio One	655083	http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/37_11/13221/
透明板膜	Perkin Elmer	1450-461	http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Product/ID/1450-461
siRNA文库	Thermo Scientific	On-Target Plus	http://www.thermoscientificbio.com/rnai-and-custom-rna-synthesis/sirna/on-targetplus-sirna/search-gene/
转染试剂	Invitrogen	Lipofectamine RNAimax	http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Transfection-Selection/lipofectamine-rnaimx.html
减血清培养基	Invitrogen	Optimem	http://products.invitrogen.com/ivgn/product/31985062?ICID=search-product
DMEM	Invitrogen	41965-039	http://products.invitrogen.com/ivgn/product/41965039#
FBS	Invitrogen	16000-044	https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-product#
胰蛋白酶-EDTA	Invitrogen	25300-054	https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product#