Screening siRNA identificar Ubiquitin e ubiquitina-como reguladores do sistema de caminhos biológicos em células de mamíferos cultivadas
Summary
Aqui, descrevemos uma metodologia para realizar uma siRNA alvo "ubiquitome" tela para identificar romance ubiquitina e reguladores de ubiquitina-like da resposta celular mediada por HIF1A à hipóxia. Isto pode ser adaptado para qualquer via biológica, onde uma leitura robusta de actividade repórter está disponível.
Abstract
Modificação pós-tradução de proteínas com ubiquitina e ubiquitina como moléculas (UBLs) está a emergir como uma rede de sinalização celular dinâmica que regula diversos processos biológicos incluindo a resposta a hipoxia, Proteostase, a resposta a danos no ADN e a transcrição. Para entender melhor como UBLs regular caminhos relevantes para doenças humanas, nós compilamos uma siRNA humano "ubiquitome" biblioteca composta de 1.186 siRNA piscinas duplex segmentação todos conhecidos e componentes das vias do sistema UBL previsto. Esta biblioteca pode ser pesquisada contra uma gama de linhas de células que expressam os repórteres de diversas vias biológicas para determinar quais os componentes UBL actuam como reguladores positivos ou negativos da via em questão. Aqui, nós descrevemos um protocolo utilizando esta biblioteca para identificar ubiquitome-reguladores da resposta celular mediada pelo HIF1A a hipóxia através de um repórter de luciferase baseados em transcrição. Uma fase inicial de desenvolvimento do ensaioé realizado para estabelecer os parâmetros de rastreio adequados para a linha celular antes de realizar a tela em três fases: triagem / desconvolução primário, secundário e terciário. O uso de alvo sobre bibliotecas genoma siRNA inteiros está se tornando cada vez mais popular, pois oferece a vantagem de relatar apenas sobre os membros da via com a qual os pesquisadores estão mais interessados. Apesar das limitações inerentes de triagem siRNA, em particular falso-positivos causados por siRNA fora do alvo efeitos, a identificação dos verdadeiros inovadores reguladores das vias em questão superam essas deficiências, que podem ser superados através da realização de uma série de experimentos de controle cuidadosamente desenvolvidas.
Introduction
Modificação de proteínas com ubiquitina e ubiquitina-like moléculas (UBLs) representa um sistema bioquímico expansivo que regula diversos caminhos biológicos e respostas ao estresse. A ligação covalente de UBLs para as suas proteínas alvo pode ter vários resultados que regulam a estabilidade, localização ou função interactoma do substrato 1. Foram estabelecidas as etapas enzimáticas subjacentes modificação UBL primeiro para ubiquitina, e agora servem como paradigma para a modificação com a maioria dos UBLs, incluindo SUMO, NEDD8, ISG15 e FAT10. Para a modificação ocorrer, o grupo carboxilato da diglicina motivo UBL é activado pela primeira vez por uma enzima E1 activação para formar um tiol de alta energia que é transferida para a cisteína do sítio activo de uma enzima de conjugação de E2. O E2 depois interage com uma ligase E3-bound substrato para mediar a transferência de LBM para (geralmente) um resíduo de lisina alvo criando uma cadeia ramificada (isopéptido) ligação 2. Rodadas sucessivas de modificação pode ocorrer para construir cadeias isopeptídicas sobre o substrato, o que para ubiquitina pode ocorrer através de qualquer uma de suas sete Usinas, ou através de sua metionina N-terminal para criar cadeias de ubiquitina lineares. Essas modificações formar topologias discretos com diversos fins, tais como a criação de novos motivos de interação e direcionamento de proteínas para a degradação antes da remoção UBL por proteases especializadas. No caso da ubiquitina existem duas enzimas E1, E2 enzimas de conjugação de 30-40, pelo menos, 600 E3 ligases e aproximadamente 100 enzimas deubiquitylating (DUBs). Enquanto os caminhos são menos expansivo para os outros 10 ou mais UBLs, a complexidade geral ubiquitome oferece enorme diversidade biológica no resultado de uma modificação especial Usama Bin Laden. No entanto, enquanto as principais avanços na biologia UBL têm sido feitas, as funções celulares precisas da maioria destes componentes ubiquitome permanecem desconhecidos.
O uso de short interfering ácido ribonucleico (siRNAs) emergiu como uma ferramenta poderosa na genética inversa, devido à capacidade de siRNAs para alvejar especificamente mRNAs celulares para a destruição, permitindo que o papel dos genes individuais para ser analisada em diversos contextos biológicos 3. Telas do genoma inteiro têm sido utilizados para identificar e validar novos reguladores de muitos processos celulares, e criou uma riqueza de dados úteis acessível à comunidade científica em geral. No entanto, enquanto as telas de genomas inteiros já demonstrou ser extremamente útil, telas direcionados estão se tornando cada vez mais popular como eles são mais baratos, mais rápidos, envolvem menos de gerenciamento de dados e relatório apenas sobre os membros do genoma na qual o investigador é o mais interessado. Portanto, para entender melhor quais componentes da família processos celulares UBL estão envolvidos, nós compilamos uma biblioteca siRNA humano visando todos os conhecidos e os componentes do ubiquitome previsto. Isso inclui os UBLs, E1, E2 enzimas de activação conjugandoenzimas, ligases E3, domínio de ligação da ubiquitina (UBD) contendo proteínas e DUBs. Esta biblioteca pode ser utilizada para a tela de encontro a uma vasta gama de linhas de células repórter de problemas biológicas distintas, permitindo assim a identificação de componentes imparcial UBL novos regulam estas vias.
O protocolo a seguir descreve como executar uma rigorosa siRNA direcionado ubiquitome tela para identificar novos reguladores da resposta dependente da HIF1A à hipóxia. Sob tensão normal de oxigênio, HIF1A está sujeita a hidroxilação prolyl que faz com que ela seja reconhecida e direcionada para a degradação pelo Von Hippel Lindau (VHL) E3 ligase complexo 4. Hipóxia inibe hidroxilação prolil levando à estabilização de HIF1A e sua subsequente ligação a elementos de resposta a hipoxia (Hres) para conduzir a expressão do gene. Aqui, nós descrevemos um ecrã usando células de osteosarcoma U20S estavelmente expressando a luciferase do pirilampo sob o controlo de três cópias em tandem da HyElemento de Resposta poxia (células U20S-HRE) 5. Este protocolo pode ser adaptado para qualquer via biológica se uma leitura robusta de actividade repórter é viável e pode ser acoplado com os controlos positivos e negativos adequados.
Protocol
Representative Results
Discussion
O uso de telas siRNA ampla do genoma nas células de mamíferos tem provado ser extremamente útil na identificação de novos reguladores de vias biológicas distintas. Aqui, nós descrevemos o uso de um ecrã ubiquitome siRNA alvo para identificar reguladores da resposta celular mediada pelo HIF1A a hipóxia. Telas alvejados estão se tornando cada vez mais atraente como eles são geralmente mais barato, mais rápido, mais fácil de gerenciar e relatório apenas sobre os componentes da via em que os investigadores est…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo Wellcome Trust, Glaxosmithkline (GSK) eo Instituto Escocês de Sinalização Celular (agora parte da Fosforilação MRC e unidade ubiquitinação).
Materials
| Automated Liquid Dispenser | Fluid-X | XPP-721 | http://www.fluidx.eu/BIOTRACK/xpp-721-liquid-handling-system.html |
| Automated cell counter | Nexcelom Bioscience | Cellometer Auto T4 | http://www.nexcelom.com/Cellometer-Auto-T4/index.html |
| Hypoxia Workstation | Ruskin | In vivo2 300 | http://www.ruskinn.com/products/invivo2300 |
| Automated Cell Dispenser | Thermo Scientific | Matrix Wellmate | http://www.matrixtechcorp.com/automated/pipetting.aspx?id=11 |
| Plate Shaker | Heidolph | Titramax 1000 | http://www.heidolph-instruments.co.uk/products/shakers-mixers/platform-shakers/vibrating/titramax/titramax-1000/ |
| Luminometer | Perkin Elmer | Envision 2104 Multilabel Reader | http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Family/ID/EnVision%20Multilabel%20Plate%20Readers |
| White Walled Assay Plate | Greiner Bio One | 655083 | http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/37_11/13221/ |
| Clear Plate Film | Perkin Elmer | 1450-461 | http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Product/ID/1450-461 |
| Name of the Reagent | |||
| siRNA library | Thermo Scientific | On-Target Plus | http://www.thermoscientificbio.com/rnai-and-custom-rna-synthesis/sirna/on-targetplus-sirna/search-gene/ |
| Transfection reagent | Invitrogen | Lipofectamine RNAimax | http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Transfection-Selection/lipofectamine-rnaimx.html |
| Reduced Serum Medium | Invitrogen | Optimem | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/31985062?ICID=search-product |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/41965039# |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-product# |
| Tryspin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product# |
References
- Hochstrasser, M. Origin and function of ubiquitin-like proteins. Nature. 458, 422-429 (2009).
- Schulman, B. A., Harper, J. W. Ubiquitin-like protein activation by E1 enzymes: the apex for downstream signalling pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 319-331 (2009).
- Siomi, H., Siomi, M. C. On the road to reading the RNA-interference code. Nature. 457, 396-404 (2009).
- Kaelin, W. G., Ratcliffe, P. J. Oxygen sensing by metazoans: the central role of the HIF hydroxylase pathway. Mol Cell. 30, 393-402 (2008).
- Melvin, A., Mudie, S., Rocha, S. The chromatin remodeler ISWI regulates the cellular response to hypoxia: role of FIH. Mol Biol Cell. 22, 4171-4181 (2011).
- Bhinder, B., Djaballah, H. A simple method for analyzing actives in random RNAi screens: introducing the "H Score" for hit nomination & gene prioritization. Comb Chem High Throughput Screen. 15, 686-704 (2012).
- Bett, J. S., et al. The P-body component USP52/PAN2 is a novel regulator of HIF1A mRNA stability. Biochem J. 451, 185-194 (2013).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).
- Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat Methods. 6, 569-575 (2009).
- Stagg, H. R., et al. The TRC8 E3 ligase ubiquitinates MHC class I molecules before dislocation from the ER. J Cell Biol. 186, 685-692 (2009).
- Zhang, Y., et al. RNF146 is a poly(ADP-ribose)-directed E3 ligase that regulates axin degradation and Wnt signalling. Nat Cell Biol. 13, 623-629 (2011).
- Jackson, A. L., et al. Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi. Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).
- Birmingham, A., et al. 3′ UTR seed matches, but not overall identity, are associated with RNAi off-targets. Nat Methods. 3, 199-204 (2006).
- . Whither RNAi. Nat Cell Biol. 5, 489-490 (2003).
