siRNA Screening naar Ubiquitin en Ubiquitin-achtig systeem regulatoren van biologische pathways identificeren in gekweekte zoogdiercellen
Summary
Hier beschrijven we een methode om een gerichte siRNA "ubiquitome" scherm om nieuwe ubiquitine en ubiquitine-achtige regulatoren van de-HIF1a gemedieerde cellulaire respons op hypoxie identificeren voeren. Dit kan worden aangepast aan elke biologische weg wanneer een robuuste uitlezing van reporter-activiteit beschikbaar.
Abstract
Post-translationele modificatie van proteïnen met ubiquitine en ubiquitine-achtige moleculen (UBLS) is in opkomst als een dynamische cellulaire signalerende netwerk dat diverse biologische processen zoals de hypoxierespons, proteostasis de DNA schade respons en transcriptie reguleert. Om beter te begrijpen hoe UBLS reguleren wegen naar menselijke ziekten relevant, hebben we een mens siRNA gecompileerd "ubiquitome" bibliotheek bestaande uit 1186 siRNA duplex zwembaden gericht zijn op alle bekende en voorspelde componenten van UBL systeem trajecten. Deze bibliotheek kan worden gescreend tegen een reeks van cellijnen die verslaggevers van diverse biologische pathways te bepalen welke UBL onderdelen fungeren als positieve of negatieve regulatoren van de route in kwestie. Hier beschrijven we een protocol gebruik deze bibliotheek ubiquitome-regulatoren van de HIF1a-gemedieerde cellulaire respons op hypoxie via een transcriptie gebaseerde luciferase reporter identificeren. Een eerste test ontwikkelingsfasewordt uitgevoerd om geschikte screening parameters van de cellijn vast voordat u het scherm in drie fasen: de primaire, secundaire en tertiaire / deconvolutie screening. Het gebruik van gerichte dan hele genoom siRNA bibliotheken wordt steeds populairder want het biedt het voordeel van de rapportage alleen de leden van het pad waarmee de onderzoekers zijn het meest geïnteresseerd. Ondanks de inherente beperkingen van siRNA screening, met name vals-positieven door siRNA off-target effecten, de identificatie van echte nieuwe regulatoren van de routes betrokken opwegen tegen deze tekortkomingen die worden overwonnen door het uitvoeren van een reeks zorgvuldig uitgevoerde controle-experimenten.
Introduction
Modificatie van eiwitten met ubiquitine en ubiquitine-achtige moleculen (UBLS) vertegenwoordigt een expansieve biochemisch systeem dat diverse biologische pathways en stress reacties regelt. De covalente binding van UBLS hun doeleiwitten kunnen verschillende uitkomsten regelen van de stabiliteit, lokalisatie, functie of interactoom van het substraat 1. De enzymatische stappen onderliggende UBL modificatie werden voor het eerst vastgesteld voor ubiquitine, en nu dienen als een paradigma voor modificatie met de meeste UBLS, met inbegrip van SUMO, NEDD8, ISG15 en FAT10. Voor wijzigingen voordoen, worden de carboxylaat groep BMW diglycine motief eerst geactiveerd door een E1 activerend enzym een hoge energie-thiol dat wordt overgebracht naar de actieve plaats van een cysteïne E2 conjugerend enzym vormen. De E2 vervolgens interactie met een substraat gebonden E3 ligase overdracht van BMW bemiddelen op (meestal) een doelstelling lysinerest tot een vertakte keten (isopeptide) hefinrichting 2. Opeenvolgende ronden van modificatie kunnen ondergaan isopeptide ketens bouwen op het substraat, die voor ubiquitine kan plaatsvinden via elk van de zeven lysines of door de N-terminale methionine lineaire ubiquitine ketens maken. Deze wijzigingen vormen discrete topologieën met diverse doeleinden, zoals het creëren van nieuwe interactie motieven en targeting eiwitten voor degradatie voorafgaand aan UBL verwijdering door gespecialiseerde proteasen. Bij ubiquitine er twee enzymen E1, E2 30-40 conjugeren enzymen, ten minste 600 E3 ligasen en ongeveer 100 deubiquitylating enzymen (DUBS). Terwijl de paden zijn minder expansief voor de andere 10 of zo UBLS, de complexiteit van het geheel ubiquitome biedt enorme diversiteit in de biologische uitkomst van een bepaald UBL modificatie. Echter, terwijl de grote vooruitgang in de UBL biologie zijn gemaakt, de precieze cellulaire rollen van de meerderheid van deze ubiquitome componenten onbekend blijven.
Het gebruik van korte interfering RNA (siRNA's) is ontstaan als een krachtig instrument reverse genetica vanwege het vermogen van siRNAs specifiek gericht cellulaire mRNA voor vernietiging, waardoor de rol van individuele genen in verschillende biologische 3 contexten worden onderzocht. Hele genoom schermen zijn gebruikt om nieuwe regulatoren van vele cellulaire processen te identificeren en te valideren, en een schat aan bruikbare gegevens toegankelijk zijn voor de bredere wetenschappelijke gemeenschap hebben gecreëerd. Echter, terwijl de hele genoom schermen hebben bewezen zeer nuttig, gerichte schermen worden steeds populairder omdat ze goedkoper, sneller, betrekken minder data management en rapportering uitsluitend betrekking op de leden van het genoom waarin de onderzoeker is het meest geïnteresseerd. Daarom beter begrijpen welke cellulaire processen UBL familie componenten betrokken bij hebben wij een humane bibliotheek siRNA gericht alle bekende en voorspelde elementen van de ubiquitome samengesteld. Dit omvat de UBLS, E1 activerende enzymen, E2 conjugerendeenzymen, E3 ligasen, ubiquitine-bindend domein (UBD)-bevattende eiwitten en dubs. Deze bibliotheek kan worden gebruikt voor het screenen tegen een groot aantal reporter cellijnen van verschillende biologische problemen, waardoor de onpartijdige identificatie van nieuwe BMW onderdelen voor deze routes.
Het volgende protocol wordt beschreven hoe u een strenge gerichte siRNA ubiquitome scherm om nieuwe regelaars van het HIF1a-afhankelijke respons op hypoxie identificeren voeren. Onder normale zuurstofspanning, HIF1a is onderworpen aan prolyl hydroxylering die ervoor zorgt dat het wordt erkend en gericht voor degradatie door het Von Hippel Lindau (VHL) E3 ligase complex 4. Hypoxie remt prolyl hydroxylering leiden tot de stabilisatie van HIF1a en de daaropvolgende binding aan hypoxie respons elementen (hres) om genexpressie. Hier beschrijven we een scherm met U20S osteosarcoomcellen stabiel tot expressie vuurvlieg luciferase onder controle van drie tandem kopieën van de Hypoxia Response Element (U20S-HRE cellen) 5. Dit protocol kan worden aangepast voor elke biologische weg als een robuust aflezing van reporter activiteit haalbaar en kan worden gekoppeld met positieve en negatieve controles.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het gebruik van genoom-brede siRNA schermen in zoogdiercellen heeft bewezen zeer waardevol bij het identificeren van nieuwe regulatoren van verschillende biologische processen te zijn. Hier hebben wij het gebruik van een gerichte ubiquitome siRNA scherm regulatoren van de HIF1a gemedieerde cellulaire respons op hypoxie identificeren beschreven. Gerichte schermen steeds aantrekkelijk als algemeen goedkoper, sneller, gemakkelijker te beheren en verslag pas op het pad onderdelen waarin de onderzoekers geïnteresseerd …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door The Wellcome Trust, Glaxosmithkline (GSK) en de Schotse Instituut voor Cell Signalling (nu onderdeel van het MRC Proteïne Fosforylatie en ubiquitylation unit).
Materials
| Automated Liquid Dispenser | Fluid-X | XPP-721 | http://www.fluidx.eu/BIOTRACK/xpp-721-liquid-handling-system.html |
| Automated cell counter | Nexcelom Bioscience | Cellometer Auto T4 | http://www.nexcelom.com/Cellometer-Auto-T4/index.html |
| Hypoxia Workstation | Ruskin | In vivo2 300 | http://www.ruskinn.com/products/invivo2300 |
| Automated Cell Dispenser | Thermo Scientific | Matrix Wellmate | http://www.matrixtechcorp.com/automated/pipetting.aspx?id=11 |
| Plate Shaker | Heidolph | Titramax 1000 | http://www.heidolph-instruments.co.uk/products/shakers-mixers/platform-shakers/vibrating/titramax/titramax-1000/ |
| Luminometer | Perkin Elmer | Envision 2104 Multilabel Reader | http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Family/ID/EnVision%20Multilabel%20Plate%20Readers |
| White Walled Assay Plate | Greiner Bio One | 655083 | http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/37_11/13221/ |
| Clear Plate Film | Perkin Elmer | 1450-461 | http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Product/ID/1450-461 |
| Name of the Reagent | |||
| siRNA library | Thermo Scientific | On-Target Plus | http://www.thermoscientificbio.com/rnai-and-custom-rna-synthesis/sirna/on-targetplus-sirna/search-gene/ |
| Transfection reagent | Invitrogen | Lipofectamine RNAimax | http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Transfection-Selection/lipofectamine-rnaimx.html |
| Reduced Serum Medium | Invitrogen | Optimem | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/31985062?ICID=search-product |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/41965039# |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-product# |
| Tryspin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product# |
References
- Hochstrasser, M. Origin and function of ubiquitin-like proteins. Nature. 458, 422-429 (2009).
- Schulman, B. A., Harper, J. W. Ubiquitin-like protein activation by E1 enzymes: the apex for downstream signalling pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 319-331 (2009).
- Siomi, H., Siomi, M. C. On the road to reading the RNA-interference code. Nature. 457, 396-404 (2009).
- Kaelin, W. G., Ratcliffe, P. J. Oxygen sensing by metazoans: the central role of the HIF hydroxylase pathway. Mol Cell. 30, 393-402 (2008).
- Melvin, A., Mudie, S., Rocha, S. The chromatin remodeler ISWI regulates the cellular response to hypoxia: role of FIH. Mol Biol Cell. 22, 4171-4181 (2011).
- Bhinder, B., Djaballah, H. A simple method for analyzing actives in random RNAi screens: introducing the "H Score" for hit nomination & gene prioritization. Comb Chem High Throughput Screen. 15, 686-704 (2012).
- Bett, J. S., et al. The P-body component USP52/PAN2 is a novel regulator of HIF1A mRNA stability. Biochem J. 451, 185-194 (2013).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).
- Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat Methods. 6, 569-575 (2009).
- Stagg, H. R., et al. The TRC8 E3 ligase ubiquitinates MHC class I molecules before dislocation from the ER. J Cell Biol. 186, 685-692 (2009).
- Zhang, Y., et al. RNF146 is a poly(ADP-ribose)-directed E3 ligase that regulates axin degradation and Wnt signalling. Nat Cell Biol. 13, 623-629 (2011).
- Jackson, A. L., et al. Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi. Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).
- Birmingham, A., et al. 3′ UTR seed matches, but not overall identity, are associated with RNAi off-targets. Nat Methods. 3, 199-204 (2006).
- . Whither RNAi. Nat Cell Biol. 5, 489-490 (2003).
