siRNA contrôle pour la ubiquitine et les régulateurs du système ubiquitine-comme des voies biologiques dans des cellules de mammifères en culture
Summary
Ici, nous décrivons une méthode pour effectuer un siRNA ciblés écran "ubiquitome" pour identifier de nouveaux régulateurs de l'ubiquitine et ubiquitine de la réponse cellulaire médiée HIF1A à l'hypoxie. Ceci peut être adapté à n'importe quelle voie biologique où une lecture robuste de l'activité du rapporteur est disponible.
Abstract
Modification post-traductionnelle des protéines avec l'ubiquitine et ubiquitine (UBL) molécules est en train de devenir un réseau de signalisation cellulaire dynamique qui régule diverses voies biologiques, y compris la réponse à l'hypoxie, proteostasis, la réponse aux dommages de l'ADN et la transcription. Pour mieux comprendre comment UBL réglementer les filières pertinentes à la maladie humaine, nous avons compilé un siRNA humain "ubiquitome" bibliothèque composée de 1186 siARN piscines duplex ciblant tous connus et prévus des composants de voies du système UBL. Cette bibliothèque peut être projeté contre un éventail de lignées cellulaires exprimant journalistes de diverses voies biologiques pour déterminer quels composants UBL agissent comme régulateurs positifs ou négatifs de la voie en question. Ici, nous décrivons un protocole utilisant cette bibliothèque pour identifier ubiquitome-régulateurs de la réponse cellulaire médiée par HIF1A à l'hypoxie en utilisant un rapporteur de luciférase à base de transcription. Un stade de développement de l'essai initialest effectuée pour établir les paramètres de dépistage appropriés de la lignée cellulaire avant d'effectuer l'écran en trois étapes: dépistage / déconvolution primaire, secondaire et tertiaire. L'utilisation de bibliothèques ciblée sur génome entier de siRNA est de plus en plus populaire car il offre l'avantage de rendre compte uniquement sur les membres de la voie avec laquelle les enquêteurs sont plus intéressés. Malgré les limites inhérentes de dépistage siRNA, en particulier les faux positifs causés par siARN effets hors-cible, l'identification des véritables nouveaux régulateurs des voies en question l'emportent sur ces lacunes, qui peuvent être surmontées par l'exécution d'une série d'expériences de contrôle attentivement entreprises.
Introduction
Modification des protéines avec l'ubiquitine et ubiquitine (UBL) molécules représente un système biochimique expansive qui régule diverses voies biologiques et des réactions de stress. La fixation covalente d'UBL à leurs protéines cibles peut avoir divers effets de régulation de la stabilité, la localisation, la fonction ou interactome du substrat 1. Les étapes enzymatiques sous-jacents UBL modification ont d'abord été établies pour l'ubiquitine, et maintenant servir de paradigme pour la modification avec la plupart des UBL, y compris SUMO, NEDD8, ISG15 et FAT10. Pour la modification de se produire, le groupe carboxylate de la diglycine UBL motif est d'abord activée par une enzyme activant E1 pour former un thiol de haute énergie qui est transférée à la cystéine du site actif d'une enzyme de conjugaison E2. Le E2 interagit ensuite avec une ligase E3 lié au substrat de servir de médiateur de transfert de la LBM sur (habituellement) un résidu de lysine cible création d'une chaîne ramifiée (isopeptidique) 2 tringlerie. Les cycles successifs de modification peuvent se produire pour construire des chaînes isopeptidiques sur le substrat, ce qui peut se produire pour l'ubiquitine à travers l'une de ses sept lysines, ou par l'intermédiaire de sa méthionine N-terminale pour créer des chaînes linéaires d'ubiquitine. Ces modifications font topologies discrètes avec des fins diverses telles que la création de nouveaux motifs d'interaction et le ciblage des protéines pour la dégradation avant l'enlèvement UBL par des protéases spécialisées. Dans le cas de l'ubiquitine E1, il existe deux enzymes, enzymes de conjugaison E2 30 à 40, au moins 600 ligases E3 et environ 100 enzymes deubiquitylating (DUB). Alors que les voies sont moins expansive pour les 10 ou si d'autres UBL, la complexité globale de ubiquitome offre énorme diversité biologique dans le résultat d'une modification UBL particulier. Cependant, alors que des avancées majeures dans UBL biologie ont été faits, les rôles cellulaires précises de la majorité de ces composants ubiquitome restent inconnus.
L'utilisation de short interfering acide ribonucléique (siRNA) a émergé comme un outil puissant pour la génétique inverse en raison de la capacité de siRNA pour cibler spécifiquement ARNm cellulaires pour destruction, permettant le rôle des gènes individuels à examiner dans différents contextes biologiques 3. Criblage du génome entier ont été utilisés pour identifier et valider de nouveaux régulateurs de nombreux processus cellulaires, et ont créé une foule de données utiles accessibles à la communauté scientifique au sens large. Cependant, alors que les écrans du génome entier ont révélé extrêmement utile, écrans ciblés sont de plus en plus populaires car ils sont moins chers, plus rapides, moins impliquer la gestion de données et de rapport uniquement sur les membres du génome où le chercheur est le plus intéressé. Par conséquent, afin de mieux comprendre les processus cellulaires UBL composants de la famille sont impliqués, nous avons constitué une bibliothèque siRNA humain ciblant tous connus et prévus des composants de la ubiquitome. Cela inclut les UBL, E1, E2 activation des enzymes conjugaisondes enzymes, des ligases E3, domaine de liaison à l'ubiquitine (DLC) contenant des protéines et des DUBs. Cette bibliothèque peut être utilisée pour l'écran contre un large éventail de lignées cellulaires rapporteurs de problèmes biologiques distinctes, permettant ainsi l'identification objective des nouveaux composants de l'UBL régissant ces voies.
Le protocole suivant décrit comment effectuer une rigoureuse siRNA ciblés ubiquitome écran pour identifier de nouveaux régulateurs de la réponse de HIF1A dépendant à l'hypoxie. Sous tension normale d'oxygène, HIF1A est soumise à prolyl hydroxylation qui l'amène à être reconnue et ciblée pour la dégradation par la maladie de Von Hippel Lindau (VHL) E3 complexe ligase 4. L'hypoxie inhibe l'hydroxylation prolyl conduisant à la stabilisation des HIF1A et sa liaison ultérieure à des éléments de réponse à l'hypoxie (HRE) de conduire l'expression du gène. Ici, nous décrivons un écran à l'aide des cellules d'ostéosarcome U20S exprimant de façon stable la luciférase de luciole sous le contrôle de trois copies en tandem de l'HyResponse Element poxia (cellules U20S-EDH) 5. Ce protocole peut être adapté pour n'importe quelle voie biologique si un solide lecture de l'activité du rapporteur est réalisable et peut être couplé avec des témoins positifs et négatifs appropriés.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'utilisation d'écrans de siRNA du génome dans les cellules de mammifères s'est avérée extrêmement utile dans l'identification de nouveaux régulateurs de voies biologiques distinctes. Ici, nous avons décrit l'utilisation d'un écran de siRNA ciblé ubiquitome pour identifier des régulateurs de la réponse cellulaire médiée par HIF1A à l'hypoxie. Écrans ciblés sont de plus en plus attrayant car ils sont généralement moins cher, plus rapide, plus facile à gérer et rapport uniq…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le Wellcome Trust, GlaxoSmithKline (GSK) et l'Institut écossais pour Signalisation cellulaire (qui fait maintenant partie de la phosphorylation de la protéine MRC et de l'unité de ubiquitylation).
Materials
| Automated Liquid Dispenser | Fluid-X | XPP-721 | http://www.fluidx.eu/BIOTRACK/xpp-721-liquid-handling-system.html |
| Automated cell counter | Nexcelom Bioscience | Cellometer Auto T4 | http://www.nexcelom.com/Cellometer-Auto-T4/index.html |
| Hypoxia Workstation | Ruskin | In vivo2 300 | http://www.ruskinn.com/products/invivo2300 |
| Automated Cell Dispenser | Thermo Scientific | Matrix Wellmate | http://www.matrixtechcorp.com/automated/pipetting.aspx?id=11 |
| Plate Shaker | Heidolph | Titramax 1000 | http://www.heidolph-instruments.co.uk/products/shakers-mixers/platform-shakers/vibrating/titramax/titramax-1000/ |
| Luminometer | Perkin Elmer | Envision 2104 Multilabel Reader | http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Family/ID/EnVision%20Multilabel%20Plate%20Readers |
| White Walled Assay Plate | Greiner Bio One | 655083 | http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/37_11/13221/ |
| Clear Plate Film | Perkin Elmer | 1450-461 | http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Product/ID/1450-461 |
| Name of the Reagent | |||
| siRNA library | Thermo Scientific | On-Target Plus | http://www.thermoscientificbio.com/rnai-and-custom-rna-synthesis/sirna/on-targetplus-sirna/search-gene/ |
| Transfection reagent | Invitrogen | Lipofectamine RNAimax | http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Transfection-Selection/lipofectamine-rnaimx.html |
| Reduced Serum Medium | Invitrogen | Optimem | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/31985062?ICID=search-product |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/41965039# |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-product# |
| Tryspin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product# |
References
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