培養哺乳動物細胞内の生物学的経路のユビキチンおよびユビキチン様システムレギュレータを識別するために、siRNAのスクリーニング
Summary
ここでは、低酸素にHIF1A媒介細胞応答の新規ユビキチンおよびユビキチン様レギュレータを識別するための画面」ubiquitome」を標的としたsiRNAを実行するための方法論を説明します。これはレポーター活性のうち、堅牢な読み取りが可能な任意の生物学的経路に適合させることができる。
Abstract
ユビキチンおよびユビキチン様分子（のUbl）を有するタンパク質の翻訳後修飾は、低酸素応答、タンパク質恒常性、DNA損傷応答及び転写を含む多様な生物学的経路を調節ダイナミック細胞シグナル伝達ネットワークとして浮上している。より良いのUblは、ヒトの疾患に関連する経路を調節する方法を理解するために、我々は、UBLシステム経路のすべての既知の予測成分を標的1186 siRNAの二重のプールからなるヒトのsiRNA」ubiquitome」ライブラリをコンパイルしている。このライブラリは、UBL成分は、当該経路の正又は負の調節因子として作用するかを決定するために、多様な生物学的経路のレポーターを発現する細胞株の範囲に対してスクリーニングすることができる。ここでは、転写ベースのルシフェラーゼレポーターを使用して低酸素に対するHIF1A媒介細胞応答のubiquitomeレギュレーターを識別するために、このライブラリを利用したプロトコルを記述します。最初のアッセイ開発段階第一、第二および第三級/デコンボリューションスクリーニング：三段階でのスクリーニングを実施する前に、細胞株の適切なスクリーニングパラメータを確立するために行われる。それが唯一の研究者が最も興味を持っているとの経路のメンバーに報告するという利点を提供するように全ゲノムsiRNAライブラリーを介してターゲットの使用は、ますます人気が高まっています。 siRNAのスクリーニングの固有の制限にもかかわらず、siRNAのオフターゲット効果に起因する特定の偽陽性で、問題となっている経路の本物の小説制御因子の同定は慎重に行っ制御一連の実験を実施することによって克服することができるこれらの欠点を上回る。
Introduction
ユビキチンおよびユビキチン様分子（のUbl）とのタンパク質の修飾は、多様な生物学的経路とストレス反応を調節広大な生化学システムを表します。彼らの標的タンパク質に対するのUblの共有結合は、安定性、局在性、機能または基板1のインタラクトームを規制する様々な成果を持つことができます。 UBLの変更の基礎となる酵素工程は、まず、ユビキチンのために設立され、現在ではSUMO、NEDD8、ISG15およびFAT10を含むほとんどのUbl、との修正のためのパラダイムとして機能した。修飾が起こるためには、UBLのジグリシンモチーフのカルボキシレート基は、第E2結合酵素の活性部位システインへ転送される高エネルギーチオールを形成するためにE1活性化酵素により活性化される。 E2は、その後、（通常は）分枝鎖（イソ）を作成し、ターゲットのリジン残基が結合2にUBLの転写を媒介する基質結合E3リガーゼと相互作用する。修正の連続ラウンドは、ユビキチンリニアユビキチン鎖を作成し、その7リジンのいずれかを介して、またはそのN末端メチオニンを介して起こり得る基板上にイソペプチドチェーンを構築するために発生する可能性があります。これらの変更は、このような従来の専門プロテアーゼによるUBLの除去に新たな相互作用モチーフを作成し、分解のためにタンパク質を標的として、多様な目的に離散トポロジーを形成している。ユビキチンの場合、2つのE1酵素、30〜40のE2結合酵素、少なくとも600のE3リガーゼと約100脱ユビキチン化酵素（DUBの）があります。経路は、他の10かそこらのUblはあまり広大ですが、全体的なubiquitomeの複雑さは、特定のUBL改変の生物学的結果に大きな多様性を与える。 UBL生物学における大きな進歩がなされてきたがしかし、これらubiquitome部品の大多数の正確な細胞の役割は不明のまま。
short int型の使用erferingリボ核酸（siRNA）が原因、特に個々の遺伝子の役割は、さまざまな生物学的状況3で調べることができるように、破壊のための細胞mRNAを標的とするsiRNAの能力に逆遺伝学の強力なツールとして浮上している。全ゲノムスクリーンは、多くの細胞プロセスの新たな規制当局を特定し、検証するために使用されており、より広い科学界にアクセス可能な有用なデータが豊富に作成しました。全ゲノムスクリーンは非常に有用であることが証明されているがしかし、対象となる画面は、彼らが安くなっていますように、速く、唯一の研究者が最も興味のあるゲノムのメンバーにはあまりデータ管理とレポートを伴い、ますます人気が高まっている。そのため、より良い細胞プロセスUBLファミリーの構成要素が関与しているかを理解するために、我々はすべての知られてubiquitomeのコンポーネントを予測を対象とした、人間のsiRNAライブラリーをコンパイルしている。これはのUbl、E1活性化酵素、E2共役が含まれてい酵素、E3リガーゼ、ユビキチン結合ドメイン（UBD）含有タンパク質とのDUB。このライブラリは、このように、これらの経路を支配する新規なUBL成分の公平な同定を可能にする、異なる生物学的問題のレポーター細胞株の広い範囲に対してスクリーニングすることができる。
以下のプロトコルは、低酸素に対するHIF1A依存性応答の新規制御因子を特定するために、厳格な標的としたsiRNA ubiquitome画面を実行する方法について説明します。通常の酸素分圧の下では、HIF1Aは、フォン·ヒッペル·リンドウ（VHL）E3リガーゼ複合体4によって認識され、分解の標的させるプロリルヒドロキシル化の対象となります。低酸素症は、HIF1Aの安定化につながるプロリルヒドロキシル化を阻害し、その後の低酸素応答エレメント（HRE）に結合する遺伝子の発現を駆動する。ここでは、安定的にハイの三タンデムコピーの制御下でホタルルシフェラーゼを発現U20S骨肉腫細胞を使用して画面を記述poxia応答エレメント（U20S-HRE細胞）5。レポーター活性の強固な読み出しが達成可能であり、適切な陽性および陰性対照とカップリングすることができる場合に、このプロトコルは、任意の生物学的な経路に適合させることができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
哺乳動物細胞におけるゲノムワイドなsiRNAスクリーンの使用は、異なる生物学的経路の新規な調節因子を同定するのに非常に有益であることが証明された。ここでは、低酸素に対するHIF1A媒介性細胞応答の調節因子を同定するための標的ubiquitome siRNAスクリーニングの使用が記載されている。対象となる画面は、彼らは一般的に安価であるように、より速く、ますます魅力的になってきて簡単?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、ウェルカムトラスト、グラクソ·スミスクライン（GSK）とセルシグナリングのためのスコットランド研究所（MRCのタンパク質リン酸化とユビキチン化ユニットの一部）によってサポートされていました。
Materials
| Automated Liquid Dispenser | Fluid-X | XPP-721 | http://www.fluidx.eu/BIOTRACK/xpp-721-liquid-handling-system.html |
| Automated cell counter | Nexcelom Bioscience | Cellometer Auto T4 | http://www.nexcelom.com/Cellometer-Auto-T4/index.html |
| Hypoxia Workstation | Ruskin | In vivo2 300 | http://www.ruskinn.com/products/invivo2300 |
| Automated Cell Dispenser | Thermo Scientific | Matrix Wellmate | http://www.matrixtechcorp.com/automated/pipetting.aspx?id=11 |
| Plate Shaker | Heidolph | Titramax 1000 | http://www.heidolph-instruments.co.uk/products/shakers-mixers/platform-shakers/vibrating/titramax/titramax-1000/ |
| Luminometer | Perkin Elmer | Envision 2104 Multilabel Reader | http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Family/ID/EnVision%20Multilabel%20Plate%20Readers |
| White Walled Assay Plate | Greiner Bio One | 655083 | http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/37_11/13221/ |
| Clear Plate Film | Perkin Elmer | 1450-461 | http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Product/ID/1450-461 |
| Name of the Reagent | |||
| siRNA library | Thermo Scientific | On-Target Plus | http://www.thermoscientificbio.com/rnai-and-custom-rna-synthesis/sirna/on-targetplus-sirna/search-gene/ |
| Transfection reagent | Invitrogen | Lipofectamine RNAimax | http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Transfection-Selection/lipofectamine-rnaimx.html |
| Reduced Serum Medium | Invitrogen | Optimem | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/31985062?ICID=search-product |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/41965039# |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-product# |
| Tryspin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product# |
References
- Hochstrasser, M. Origin and function of ubiquitin-like proteins. Nature. 458, 422-429 (2009).
- Schulman, B. A., Harper, J. W. Ubiquitin-like protein activation by E1 enzymes: the apex for downstream signalling pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 319-331 (2009).
- Siomi, H., Siomi, M. C. On the road to reading the RNA-interference code. Nature. 457, 396-404 (2009).
- Kaelin, W. G., Ratcliffe, P. J. Oxygen sensing by metazoans: the central role of the HIF hydroxylase pathway. Mol Cell. 30, 393-402 (2008).
- Melvin, A., Mudie, S., Rocha, S. The chromatin remodeler ISWI regulates the cellular response to hypoxia: role of FIH. Mol Biol Cell. 22, 4171-4181 (2011).
- Bhinder, B., Djaballah, H. A simple method for analyzing actives in random RNAi screens: introducing the "H Score" for hit nomination & gene prioritization. Comb Chem High Throughput Screen. 15, 686-704 (2012).
- Bett, J. S., et al. The P-body component USP52/PAN2 is a novel regulator of HIF1A mRNA stability. Biochem J. 451, 185-194 (2013).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).
- Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat Methods. 6, 569-575 (2009).
- Stagg, H. R., et al. The TRC8 E3 ligase ubiquitinates MHC class I molecules before dislocation from the ER. J Cell Biol. 186, 685-692 (2009).
- Zhang, Y., et al. RNF146 is a poly(ADP-ribose)-directed E3 ligase that regulates axin degradation and Wnt signalling. Nat Cell Biol. 13, 623-629 (2011).
- Jackson, A. L., et al. Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi. Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).
- Birmingham, A., et al. 3′ UTR seed matches, but not overall identity, are associated with RNAi off-targets. Nat Methods. 3, 199-204 (2006).
- . Whither RNAi. Nat Cell Biol. 5, 489-490 (2003).
