siRNA Screening zu Ubiquitin und Ubiquitin-ähnlichen System Regler der biologischen Stoffwechselwege in kultivierten Säugerzellen identifizieren
Summary
Hier beschreiben wir eine Methode, um eine gezielte siRNA "ubiquitome"-Bildschirm, um neue Ubiquitin und Ubiquitin-ähnliche Regulatoren des HIF1A-vermittelte zelluläre Antwort auf Hypoxie zu identifizieren durchzuführen. Dies kann zu jedem biologischen Weg, wo ein robuster Auslesen der Reporteraktivität ist angepasst werden.
Abstract
Posttranslationale Modifikation von Proteinen mit Ubiquitin und Ubiquitin-artige Moleküle (UBLs) als dynamische Zellsignalisierungsnetz, die verschiedene biologische Pfade einschließlich der Hypoxie-Antwort, Proteostase, die die DNA-Reparatur und Transkription reguliert Schwellen. Um besser zu verstehen, wie UBLs regeln für die menschliche Krankheitsbahnen, haben wir eine menschliche siRNA zusammengestellt "ubiquitome" Bibliothek, bestehend aus 1.186 siRNA-Duplex-Pools gezielt alle bekannten und vorhergesagten Komponenten der UBL-System Wege. Diese Bibliothek kann gegen eine Reihe von Zelllinien, die Reporter von verschiedenen biologischen Wege, um zu bestimmen, die UBL Komponenten wirken als positive oder negative Regulatoren des Weges in Frage zu sehen sein. Hier beschreiben wir ein Protokoll unter Verwendung dieser Bibliothek in ubiquitome-Regulatoren des HIF1A-vermittelte zelluläre Antwort auf Hypoxie mit einem Transkriptions-basierte Luciferase-Reporter identifizieren. Eine erste Testentwicklungsstadiumdurchgeführt, um geeignete Screening-Parameter der Zelllinie, bevor Sie den Bildschirm in drei Stufen festgelegt: Primär-, Sekundär-und Tertiär / Entfaltung Screening. Der Einsatz von über gesamte Genom siRNA-Bibliotheken gezielt wird immer beliebter, denn es bietet den Vorteil der Berichterstattung nur auf die Mitglieder der Weg, mit dem die Ermittler am meisten interessiert sind. Trotz inhärenten Grenzen der siRNA-Screening, insbesondere Falsch-Positiven von siRNA Off-Target-Effekte verursacht, die Identifizierung neuer Regulatoren echt der Wege in Frage, überwiegen diese Mängel, die durch die Durchführung einer Reihe von sorgfältig durchgeführten Kontrollexperimente überwunden werden können.
Introduction
Modifikation von Proteinen mit Ubiquitin und Ubiquitin-ähnlichen Molekülen (UBLs) stellt eine expansive biochemischen Systems, die verschiedene biologische Pfade und Stress-Reaktionen reguliert. Die kovalente Bindung von UBLs ihre Zielproteine können verschiedene Ergebnisse Regulierung der Stabilität, Lokalisierung, Funktion oder interactome des Substrats 1 aufweisen. Die enzymatischen Schritte UBL Änderung zugrunde liegenden wurden zunächst für Ubiquitin gegründet, und jetzt als Paradigma für die Modifikation mit den meisten UBLs, einschließlich SUMO, NEDD8, ISG15 und FAT10 zu dienen. Für die Modifikation auftritt, wird die Carboxylatgruppe des UBL Diglycin Motiv zunächst durch einen aktivierenden Enzym E1 aktiviert, um einen Hochenergie-thiol, die dem Cystein des aktiven Zentrums eines konjugierenden Enzym E2 übertragen wird, zu bilden. Die E2 interagiert dann mit einem substratgebundenen E3-Ligase, um die Übertragung des UBL auf (in der Regel) eine Ziellysinrest Schaffung eines verzweigtkettigen (Isopeptid) Zugstange 2 zu vermitteln. Aufeinanderfolgende Runden der Modifikation kann auftreten Isopeptid Ketten auf dem Substrat, die für Ubiquitin kann durch jedes der sieben Lysine auftreten oder durch ihre N-terminale Methionin zu bauen, um lineare Ubiquitin-Ketten zu erzeugen. Diese Änderungen bilden diskrete Topologien mit verschiedensten Zwecke wie die Erstellung von neuen Interaktionsmotiven und Targeting-Proteine für den Abbau vor UBL Entfernung durch Fach Proteasen. Im Fall von Ubiquitin zwei E1 Enzyme, 30-40 E2 konjugierenden Enzyme, mindestens 600 E3-Ligasen und etwa 100 deubiquitylating Enzyme (DUBs). Während die Wege sind für die anderen 10 oder so UBLs weniger expansiv, bietet die Gesamt ubiquitome Komplexität große Vielfalt in der biologischen Ergebnis einer bestimmten UBL Änderung. , Während die großen Fortschritte in der UBL Biologie gemacht worden sind, die genauen zellulären Rollen von der Mehrheit dieser ubiquitome Komponenten bleiben jedoch unbekannt.
Die Verwendung von short interfering Ribonukleinsäure (siRNA) als ein mächtiges Werkzeug in der reversen Genetik aufgrund der Fähigkeit von siRNAs, um gezielt zellulären mRNAs für die Zerstörung entstanden, so dass die Rolle einzelner Gene in verschiedenen biologischen Zusammenhängen 3 untersucht werden. Gesamtgenom-Bildschirme wurden zur Identifizierung und Validierung neuer Regulatoren vieler zellulärer Prozesse und haben eine Fülle von nützlichen Daten zugänglich zu weiteren wissenschaftlichen Community. Doch während des gesamten Genoms Bildschirme äußerst nützlich erwiesen, sind gezielte Bildschirme immer beliebter, da sie billiger sind, schneller, beinhalten weniger Datenmanagement und Bericht nur auf Mitglieder des Genoms, in dem die Ermittler am meisten interessiert. Deshalb, um besser zu verstehen, welche zellulären Prozesse UBL Familien Komponenten beteiligt sind, haben wir eine menschliche siRNA-Bibliothek gezielt alle bekannten und vorhergesagten Komponenten des ubiquitome zusammengestellt. Dies beinhaltet die UBLs, E1 aktivierende Enzyme, E2 konjugierendeEnzyme, E3-Ligasen, Ubiquitin-bindende Domäne (UBD) enthaltende Proteine und DUBs. Diese Bibliothek kann auf Bildschirm gegen ein breites Spektrum von Reporter-Zelllinien von verschiedenen biologischen Fragestellungen verwendet werden, so dass die unvoreingenommene Identifizierung neuer Komponenten UBL über diese Wege.
Das folgende Protokoll beschreibt, wie eine strenge gezielte siRNA ubiquitome Bildschirm, um neue Regulatoren der HIF1A abhängige Reaktion auf Hypoxie zu identifizieren durchzuführen. Unter normalen Sauerstoffspannung ist HIF1A unterliegen Prolylhydroxylierung, die es von der Von Hippel Lindau (VHL)-E3-Ligase-Komplex 4 erkannt und für den Abbau gezielt verursacht. Hypoxie hemmt Prolylhydroxylierung, die zur Stabilisierung der HIF1A und die anschließende Bindung an Hypoxie-Response-Elemente (HRE), um die Genexpression zu fahren. Hier mit U20S Osteosarkom-Zellen unter der Kontrolle von drei Tandemkopien der Hy stabil exprimieren Luciferase beschreiben wir eine BildschirmHypoxie-Response-Faktor (U20S-HRE-Zellen) 5. Dieses Protokoll kann für jeden biologischen Weg angepasst werden, wenn ein robustes Auslesen der Reporteraktivität erreichbar ist und mit geeigneten positiven und negativen Kontrollen gekoppelt werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Verwendung von genomweiten siRNA-Bildschirme in Säugerzellen hat sich als äußerst wertvoll bei der Identifizierung neuer Regulatoren von verschiedenen biologischen Wege zu sein. Hier haben wir den Einsatz einer gezielten ubiquitome siRNA Bildschirm, um Regulatoren des HIF1A-vermittelte zelluläre Antwort auf Hypoxie zu identifizieren beschrieben. Gezielte Bildschirme werden immer attraktiver, da sie in der Regel billiger, schneller, einfacher zu verwalten und Bericht nur auf den Weg Komponenten, in denen die Ermi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von The Wellcome Trust, Glaxosmithkline (GSK) und der schottischen Institut für Zelluläre Signaltransduktion (jetzt Teil des MRC Protein-Phosphorylierung und Ubiquitinierung Unit) unterstützt.
Materials
| Automated Liquid Dispenser | Fluid-X | XPP-721 | http://www.fluidx.eu/BIOTRACK/xpp-721-liquid-handling-system.html |
| Automated cell counter | Nexcelom Bioscience | Cellometer Auto T4 | http://www.nexcelom.com/Cellometer-Auto-T4/index.html |
| Hypoxia Workstation | Ruskin | In vivo2 300 | http://www.ruskinn.com/products/invivo2300 |
| Automated Cell Dispenser | Thermo Scientific | Matrix Wellmate | http://www.matrixtechcorp.com/automated/pipetting.aspx?id=11 |
| Plate Shaker | Heidolph | Titramax 1000 | http://www.heidolph-instruments.co.uk/products/shakers-mixers/platform-shakers/vibrating/titramax/titramax-1000/ |
| Luminometer | Perkin Elmer | Envision 2104 Multilabel Reader | http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Family/ID/EnVision%20Multilabel%20Plate%20Readers |
| White Walled Assay Plate | Greiner Bio One | 655083 | http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/37_11/13221/ |
| Clear Plate Film | Perkin Elmer | 1450-461 | http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Product/ID/1450-461 |
| Name of the Reagent | |||
| siRNA library | Thermo Scientific | On-Target Plus | http://www.thermoscientificbio.com/rnai-and-custom-rna-synthesis/sirna/on-targetplus-sirna/search-gene/ |
| Transfection reagent | Invitrogen | Lipofectamine RNAimax | http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Transfection-Selection/lipofectamine-rnaimx.html |
| Reduced Serum Medium | Invitrogen | Optimem | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/31985062?ICID=search-product |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/41965039# |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-product# |
| Tryspin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product# |
References
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