संवर्धित स्तनधारी कोशिकाओं में जैविक रास्ते की Ubiquitin और ubiquitin की तरह सिस्टम नियामकों की पहचान siRNA स्क्रीनिंग
Summary
यहाँ, हम हाइपोक्सिया के लिए HIF1A की मध्यस्थता सेलुलर प्रतिक्रिया के उपन्यास ubiquitin और ubiquitin की तरह नियामकों की पहचान करने के लिए एक लक्षित siRNA "ubiquitome" स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए एक पद्धति का वर्णन. इस संवाददाता गतिविधि के बाहर एक मजबूत पढ़ें उपलब्ध है, जहां किसी भी जैविक मार्ग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
Abstract
Ubiquitin और ubiquitin की तरह अणुओं (UBLs) के साथ प्रोटीन की बाद translational संशोधन हाइपोक्सिया प्रतिक्रिया, Proteostasis, डीएनए की क्षति की प्रतिक्रिया और प्रतिलेखन सहित विविध जैविक रास्ते को नियंत्रित करता है कि एक गतिशील सेलुलर संकेत नेटवर्क के रूप में उभर रहा है. बेहतर UBLs मानव रोग के लिए प्रासंगिक रास्ते को विनियमित कैसे समझते हैं, हम एक मानव siRNA संकलित किया है "ubiquitome" सभी ज्ञात और UBL प्रणाली रास्ते के घटकों की भविष्यवाणी को लक्षित 1,186 siRNA द्वैध पूल से मिलकर पुस्तकालय. इस पुस्तकालय UBL घटकों प्रश्न में मार्ग की सकारात्मक या नकारात्मक नियामकों के रूप में कार्य है, जो निर्धारित करने के लिए विविध जैविक रास्ते के संवाददाताओं व्यक्त सेल लाइनों की एक श्रृंखला के खिलाफ जांच की जा सकती है. यहाँ, हम एक प्रतिलेखन आधारित luciferase संवाददाता का उपयोग हाइपोक्सिया के लिए HIF1A की मध्यस्थता सेलुलर प्रतिक्रिया की ubiquitome-नियामकों की पहचान करने के लिए इस पुस्तकालय का उपयोग एक प्रोटोकॉल का वर्णन. एक प्रारंभिक परख विकास मंचप्राथमिक, माध्यमिक और तृतीयक / deconvolution स्क्रीनिंग: तीन चरणों में स्क्रीन प्रदर्शन से पहले सेल लाइन का उपयुक्त स्क्रीनिंग मापदंडों को स्थापित करने के लिए किया जाता है. यह केवल जांचकर्ताओं सबसे रुचि रखते हैं, जिसके साथ मार्ग के सदस्यों पर रिपोर्टिंग का लाभ प्रदान करता है के रूप में पूरे जीनोम siRNA पुस्तकालयों पर लक्षित का उपयोग तेजी से लोकप्रिय होता जा रहा है. SiRNA स्क्रीनिंग के निहित सीमाओं के बावजूद, विशेष रूप से झूठी सकारात्मक siRNA बंद लक्ष्य प्रभाव की वजह से, प्रश्न में रास्ते के असली उपन्यास नियामकों की पहचान सावधानी से किए गए नियंत्रण प्रयोगों की एक श्रृंखला के प्रदर्शन से दूर किया जा सकता है, जो इन कमियों, पल्ला झुकना.
Introduction
Ubiquitin और ubiquitin की तरह अणुओं (UBLs) के साथ प्रोटीन का संशोधन विविध जैविक रास्ते और तनाव प्रतिक्रियाओं को नियंत्रित करता है कि एक विशाल जैव रासायनिक प्रणाली का प्रतिनिधित्व करता है. उनके लक्ष्य प्रोटीन के लिए UBLs के सहसंयोजक लगाव स्थिरता, स्थानीयकरण, समारोह या सब्सट्रेट 1 की interactome के विनियमन के विभिन्न परिणामों हो सकता है. UBL संशोधन अंतर्निहित एंजाइमी कदम पहले ubiquitin के लिए स्थापित किया गया है, और अब सूमो, NEDD8, ISG15 और FAT10 सहित ज्यादातर UBLs, साथ संशोधन के लिए एक प्रतिमान के रूप में काम कर रहे थे. संशोधन के लिए होते हैं, UBL diglycine मूल भाव के कार्बोक्सिलेट समूह पहले एक E2 conjugating एंजाइम सक्रिय साइट सिस्टीन को सौंप दिया है कि एक उच्च ऊर्जा thiol के लिए फार्म एक E1 को सक्रिय एंजाइम से सक्रिय है. E2 तो (आमतौर पर) एक branched श्रृंखला (isopeptide) बनाने के लिए एक लक्ष्य लाइसिन अवशेषों से उठाना 2 पर UBL के हस्तांतरण के लिए मध्यस्थता करने के लिए एक सब्सट्रेट बाध्य E3 ligase के साथ सूचना का आदान प्रदान. संशोधन के बाद के दौर रैखिक ubiquitin चेन बनाने के लिए ubiquitin के लिए अपने सात lysines के किसी भी माध्यम से हो सकता है, जो सब्सट्रेट, पर या अपनी एन टर्मिनल methionine के माध्यम से isopeptide चेन का निर्माण करने के लिए हो सकता है. इन संशोधनों के ऐसे पूर्व विशेषज्ञ proteases से UBL हटाने के लिए नई बातचीत रूपांकनों बनाने और गिरावट के लिए प्रोटीन का लक्ष्य के रूप में विविध उद्देश्यों के साथ असतत टोपोलॉजी के रूप में. Ubiquitin के मामले में दो E1 एंजाइमों, 30-40 E2 conjugating एंजाइमों, कम से कम 600 E3 ligases और लगभग 100 deubiquitylating एंजाइमों (बताती) कर रहे हैं. रास्ते अन्य 10 या तो UBLs के लिए कम प्रशस्त कर रहे हैं, समग्र ubiquitome जटिलता एक विशेष UBL संशोधन की जैविक परिणाम में विशाल विविधता देता है. UBL जीव विज्ञान में प्रमुख अग्रिमों किए गए हैं, जबकि हालांकि, इन ubiquitome घटकों के बहुमत के सटीक सेलुलर भूमिकाओं अनजान रहते हैं.
कम INT का उपयोगerfering ribonucleic एसिड (siRNAs) व्यक्तिगत जीन की भूमिका अलग अलग जैविक संदर्भों 3 में जांच करने की अनुमति के कारण विशेष रूप से विनाश के लिए सेलुलर mRNAs लक्षित करने के लिए siRNAs की क्षमता को रिवर्स आनुवंशिकी में एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा है. पूरे जीनोम स्क्रीन कई सेलुलर प्रक्रियाओं के नए नियामकों की पहचान करने और मान्य करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, और व्यापक वैज्ञानिक समुदाय के लिए सुलभ उपयोगी डेटा का खजाना बनाया है. पूरे जीनोम स्क्रीन अत्यंत उपयोगी सिद्ध कर दिया है हालांकि, जबकि लक्षित स्क्रीन वे सस्ते हैं के रूप में तेजी से लोकप्रिय होते जा रहे हैं, तेज, केवल अन्वेषक सबसे अधिक दिलचस्पी है जिसमें जीनोम के सदस्यों पर कम डेटा प्रबंधन और रिपोर्ट शामिल है. इसलिए, बेहतर सेलुलर प्रक्रियाओं UBL परिवार घटकों में शामिल हैं जो समझते हैं, हम सभी ज्ञात और ubiquitome के घटकों की भविष्यवाणी को लक्षित एक मानव siRNA पुस्तकालय संकलित किया है. इस UBLs, E1 को सक्रिय एंजाइमों, E2 conjugating शामिलएंजाइमों, E3 ligases, ubiquitin बाध्यकारी डोमेन (UBD) युक्त प्रोटीन और बताती है. इस पुस्तकालय इस प्रकार इन रास्ते गवर्निंग उपन्यास UBL घटकों की निष्पक्ष पहचान की अनुमति, विशिष्ट जैविक समस्याओं के संवाददाता सेल लाइनों की एक विस्तृत श्रृंखला के खिलाफ स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
निम्नलिखित प्रोटोकॉल एक कठोर लक्षित siRNA हाइपोक्सिया के लिए HIF1A निर्भर प्रतिक्रिया के उपन्यास नियामकों की पहचान ubiquitome स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए कैसे करें. सामान्य ऑक्सीजन तनाव के तहत, HIF1A यह वॉन Hippel Lindau (VHL) E3 ligase परिसर 4 से मान्यता प्राप्त है और गिरावट के लिए लक्षित होने का कारण बनता है कि prolyl hydroxylation के अधीन है. हाइपोक्सिया HIF1A के स्थिरीकरण के लिए अग्रणी prolyl hydroxylation को रोकता है और इसके बाद के हाइपोक्सिया प्रतिक्रिया तत्वों (hres) के लिए बाध्य जीन अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए. यहाँ, हम stably हरियाणा के तीन संगठनों ने मिलकर प्रतियों के नियंत्रण में जुगनू luciferase व्यक्त U20S osteosarcoma कोशिकाओं का उपयोग कर एक स्क्रीन का वर्णनpoxia रिस्पांस तत्व (U20S-HRE कोशिकाओं) 5. संवाददाता गतिविधि का एक मजबूत पढ़ने के लिए बाहर प्राप्त है और उचित सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के साथ मिलकर किया जा सकता है अगर यह प्रोटोकॉल किसी भी जैविक मार्ग के लिए अनुकूलित किया जा सकता.
Protocol
Representative Results
Discussion
स्तनधारी कोशिकाओं में जीनोम चौड़ा siRNA स्क्रीन का उपयोग अलग जैविक रास्ते के उपन्यास नियामकों की पहचान करने में अत्यंत मूल्यवान साबित हो गया है. यहाँ, हम हाइपोक्सिया के लिए HIF1A की मध्यस्थता सेलुलर प्रतिक?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम वेलकम ट्रस्ट, ग्लैक्सोस्मिथक्लाइन (जीएसके) और सेल सिग्नलिंग के लिए स्कॉटिश संस्थान (एमआरसी प्रोटीन phosphorylation और ubiquitylation इकाई का अब हिस्सा) द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Automated Liquid Dispenser | Fluid-X | XPP-721 | http://www.fluidx.eu/BIOTRACK/xpp-721-liquid-handling-system.html |
| Automated cell counter | Nexcelom Bioscience | Cellometer Auto T4 | http://www.nexcelom.com/Cellometer-Auto-T4/index.html |
| Hypoxia Workstation | Ruskin | In vivo2 300 | http://www.ruskinn.com/products/invivo2300 |
| Automated Cell Dispenser | Thermo Scientific | Matrix Wellmate | http://www.matrixtechcorp.com/automated/pipetting.aspx?id=11 |
| Plate Shaker | Heidolph | Titramax 1000 | http://www.heidolph-instruments.co.uk/products/shakers-mixers/platform-shakers/vibrating/titramax/titramax-1000/ |
| Luminometer | Perkin Elmer | Envision 2104 Multilabel Reader | http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Family/ID/EnVision%20Multilabel%20Plate%20Readers |
| White Walled Assay Plate | Greiner Bio One | 655083 | http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/37_11/13221/ |
| Clear Plate Film | Perkin Elmer | 1450-461 | http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Product/ID/1450-461 |
| Name of the Reagent | |||
| siRNA library | Thermo Scientific | On-Target Plus | http://www.thermoscientificbio.com/rnai-and-custom-rna-synthesis/sirna/on-targetplus-sirna/search-gene/ |
| Transfection reagent | Invitrogen | Lipofectamine RNAimax | http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Transfection-Selection/lipofectamine-rnaimx.html |
| Reduced Serum Medium | Invitrogen | Optimem | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/31985062?ICID=search-product |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/41965039# |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-product# |
| Tryspin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product# |
References
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