siRNA Screening for å identifisere Ubiquitin og Ubiquitin-lignende system regulatorer av biologiske mekanismer i dyrkede pattedyrceller
Summary
Her beskriver vi en metode for å utføre en målrettet siRNA "ubiquitome" skjermen for å identifisere romanen ubiquitin og ubiquitin-lignende regulatorer av HIF1A-mediert cellulær respons på hypoksi. Dette kan tilpasses til en hvilken som helst biologisk vei, hvor et robust lest ut av reporter-aktivitet er tilgjengelig.
Abstract
Post-translasjonell modifisering av proteiner med ubiquitin og ubiquitin-lignende molekyler (UBLs) fremstår som en dynamisk cellulære signaler nettverk som regulerer ulike biologiske mekanismer inkludert hypoksi respons, proteostasis, DNA skade respons og transkripsjon. For bedre å forstå hvordan UBLs regulere trasé som er relevante for menneskelig sykdom, har vi satt sammen en menneskelig siRNA "ubiquitome" bibliotek bestående av 1186 siRNA duplex bassenger rettet mot alle kjente og spådd komponenter av UBL system trasé. Dette biblioteket kan være skjermet mot en rekke cellelinjer som uttrykker journalister av ulike biologiske mekanismer for å avgjøre hvilken UBL komponenter fungerer som positive eller negative regulatorer av veien i spørsmålet. Her beskriver vi en protokoll utnytte dette biblioteket for å identifisere ubiquitome-regulatorer av HIF1A-mediert cellulær respons på hypoksi ved hjelp av en transkripsjon basert luciferase reporter. En innledende analyse utviklingsfaseer utført for å etablere egnede rastreringsparametre av cellelinjen før utførelse av skjermen i tre trinn: primær, sekundær og tertiær / deconvolution screening. Bruken av målrettet enn hele genomet siRNA bibliotekene blir stadig mer populært som det har fordelen av å rapportere bare på medlemmer av veien som etterforskerne er mest interessert. Til tross for iboende begrensninger siRNA screening, spesielt falske positiver forårsaket av siRNA off-target effekter, identifisering av ekte nye regulatorer av trasé i spørsmålet oppveier disse svakhetene, som kan overvinnes ved å utføre en rekke nøye gjennomført kontrolleksperimenter.
Introduction
Modifisering av proteiner med ubiquitin og ubiquitin-lignende molekyler (UBLs) representerer en ekspansiv biokjemisk system som regulerer ulike biologiske mekanismer og stressresponser. Den kovalente binding av UBLs til sine mål-proteinene kan ha ulike resultater som regulerer stabilitet, lokalisering, funksjon eller interactome av substratet 1.. Den enzymatiske trinn underliggende UBL endring, ble først etablert for ubiquitin, og nå tjene som et paradigme for modifisering med de fleste UBLs, inkludert SUMO, NEDD8, ISG15 og FAT10. For modifisering å oppstå, er karboksylat-gruppe på det UBL diglycine motivet først aktiveres av en E1 aktiverende enzym for å danne en høy-energi-tiol som er overført til det aktive stedet for cystein i en E2 conjugating enzym. Den E2 samhandler med et substrat-bundet E3 ligase til å mediere transport av UBL bort (vanligvis) et mål lysinresten skape en forgrenet kjede (isopeptide) binding 2. Suksessive runder med modifikasjon kan forekomme for å bygge isopeptide kjeder på substratet, som for ubiquitin kan skje ved en hvilken som helst av dens syv lysines, eller gjennom dens N-terminale metionin for å lage lineære ubiquitin-kjeder. Disse endringene danner diskrete topologier med ulike formål som å opprette nye samhandlings motiver og målretting proteiner for degradering før UBL fjerning av spesialist proteaser. I tilfelle av ubiquitin det to E1 enzymer, 30-40 E2 konjugering av enzymer, i det minste 600 E3 ligaser og omtrent 100 deubiquitylating enzymer (DUBS). Mens banene er mindre ekspansiv for de andre 10 eller så UBLs, gir den generelle ubiquitome kompleksitet stort mangfold i det biologiske utfallet av en bestemt UBL modifikasjon. Men mens store fremskritt i UBL biologi har blitt gjort, de presise cellulære rollene de fleste av disse ubiquitome komponenter forblir ukjent.
Bruken av korte interfering ribonukleinsyre (sirnas) har dukket opp som et kraftig verktøy i revers genetikk på grunn av muligheten for siRNAs spesifikt mot cellulære mRNA for ødeleggelse, slik at rollen til enkelte gener for å bli undersøkt i ulike biologiske sammenhenger tre. Hele genomet skjermer har blitt brukt til å identifisere og validere nye regulatorer av mange cellulære prosesser, og har skapt et vell av nyttige data tilgjengelig for den bredere vitenskapelige samfunnet. Men mens hele genomet skjermer har vist seg meget nyttig, er målrettet skjermer blir stadig mer populære som de er billigere, raskere, innebærer mindre data management og rapport bare på medlemmer av genomet hvor etterforskeren er mest interessert. Derfor, for å bedre forstå hvilke cellulære prosesser UBL familie komponenter er involvert i, har vi samlet en menneskelig siRNA bibliotek rettet mot alle kjente og spådd komponenter av ubiquitome. Dette inkluderer de UBLs, E1 aktive enzymer, E2 konjugeringsreakenzymer, ligaser E3, ubiquitin-bindende domene (UBD)-inneholdende proteiner og DuBS. Dette biblioteket kan brukes til skjermen mot et bredt spekter av rapportørcellelinjer av forskjellige biologiske problemer, og dermed gir objektive identifisering av nye UBL komponenter som styrer disse banene.
Følgende protokoll beskriver hvordan du utfører en streng målrettet siRNA ubiquitome skjermen for å identifisere nye regulatorer av HIF1A avhengig respons på hypoksi. Under normal oksygen spenning, er HIF1A lagt prolyl hydroksylering som får den til å bli anerkjent og målrettet for nedbrytning ved Von Hippel Lindau (VHL) E3 ligase kompleks fire. Hypoksi hemmer prolyl hydroksylering som fører til stabiliseringen av HIF1A og påfølgende binding til hypoksi responselementer (HRes) for å drive gene expression. Her beskriver vi en skjerm ved hjelp av U20S osteosarkom-celler stabilt uttrykker ildflue luciferase under kontroll av tre tandem kopier av Hypoxia Response Element (U20S-HRE celler) 5. Denne protokollen kan tilpasses for en hvilken som helst biologisk vei hvis en robust avlesing av reporter-aktivitet kan oppnås, og kan være kombinert med passende positive og negative kontroller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bruken av genom-wide siRNA skjermer i pattedyrceller har vist seg å være svært verdifull i å identifisere nye regulatorer av forskjellige biologiske mekanismer. Her har vi beskrevet bruken av en målrettet ubiquitome siRNA skjermen for å identifisere regulatorer av HIF1A-mediert cellulær respons til hypoksi. Målrettede skjermer blir stadig mer attraktive som de er generelt billigere, raskere, enklere å administrere og rapportere bare på komponentene løp hvor etterforskerne er interessert 7, 10, 11. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av The Wellcome Trust, GlaxoSmithKline (GSK) og den skotske Institutt for Cell Signale (nå en del av MRC Protein Fosforylering og Ubiquitylation enhet).
Materials
| Automated Liquid Dispenser | Fluid-X | XPP-721 | http://www.fluidx.eu/BIOTRACK/xpp-721-liquid-handling-system.html |
| Automated cell counter | Nexcelom Bioscience | Cellometer Auto T4 | http://www.nexcelom.com/Cellometer-Auto-T4/index.html |
| Hypoxia Workstation | Ruskin | In vivo2 300 | http://www.ruskinn.com/products/invivo2300 |
| Automated Cell Dispenser | Thermo Scientific | Matrix Wellmate | http://www.matrixtechcorp.com/automated/pipetting.aspx?id=11 |
| Plate Shaker | Heidolph | Titramax 1000 | http://www.heidolph-instruments.co.uk/products/shakers-mixers/platform-shakers/vibrating/titramax/titramax-1000/ |
| Luminometer | Perkin Elmer | Envision 2104 Multilabel Reader | http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Family/ID/EnVision%20Multilabel%20Plate%20Readers |
| White Walled Assay Plate | Greiner Bio One | 655083 | http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/37_11/13221/ |
| Clear Plate Film | Perkin Elmer | 1450-461 | http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Product/ID/1450-461 |
| Name of the Reagent | |||
| siRNA library | Thermo Scientific | On-Target Plus | http://www.thermoscientificbio.com/rnai-and-custom-rna-synthesis/sirna/on-targetplus-sirna/search-gene/ |
| Transfection reagent | Invitrogen | Lipofectamine RNAimax | http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Transfection-Selection/lipofectamine-rnaimx.html |
| Reduced Serum Medium | Invitrogen | Optimem | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/31985062?ICID=search-product |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/41965039# |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-product# |
| Tryspin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product# |
References
- Hochstrasser, M. Origin and function of ubiquitin-like proteins. Nature. 458, 422-429 (2009).
- Schulman, B. A., Harper, J. W. Ubiquitin-like protein activation by E1 enzymes: the apex for downstream signalling pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 319-331 (2009).
- Siomi, H., Siomi, M. C. On the road to reading the RNA-interference code. Nature. 457, 396-404 (2009).
- Kaelin, W. G., Ratcliffe, P. J. Oxygen sensing by metazoans: the central role of the HIF hydroxylase pathway. Mol Cell. 30, 393-402 (2008).
- Melvin, A., Mudie, S., Rocha, S. The chromatin remodeler ISWI regulates the cellular response to hypoxia: role of FIH. Mol Biol Cell. 22, 4171-4181 (2011).
- Bhinder, B., Djaballah, H. A simple method for analyzing actives in random RNAi screens: introducing the "H Score" for hit nomination & gene prioritization. Comb Chem High Throughput Screen. 15, 686-704 (2012).
- Bett, J. S., et al. The P-body component USP52/PAN2 is a novel regulator of HIF1A mRNA stability. Biochem J. 451, 185-194 (2013).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).
- Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat Methods. 6, 569-575 (2009).
- Stagg, H. R., et al. The TRC8 E3 ligase ubiquitinates MHC class I molecules before dislocation from the ER. J Cell Biol. 186, 685-692 (2009).
- Zhang, Y., et al. RNF146 is a poly(ADP-ribose)-directed E3 ligase that regulates axin degradation and Wnt signalling. Nat Cell Biol. 13, 623-629 (2011).
- Jackson, A. L., et al. Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi. Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).
- Birmingham, A., et al. 3′ UTR seed matches, but not overall identity, are associated with RNAi off-targets. Nat Methods. 3, 199-204 (2006).
- . Whither RNAi. Nat Cell Biol. 5, 489-490 (2003).
