siRNA Screening för att identifiera Ubiquitin och Ubiquitin-liknande system Regulatorer av biologiska banor i odlade däggdjursceller
Summary
Här beskriver vi en metod för att utföra en riktad siRNA "ubiquitome" skärmen för att identifiera nya ubikitin och ubiquitin-liknande regulatorer av HIF1A förmedlade cellulära svaret på hypoxi. Detta kan anpassas till varje biologisk reaktionsväg där en robust läsning av reporteraktivitet är tillgänglig.
Abstract
Post-translationell modifiering av proteiner med ubiquitin och ubiquitin-liknande molekyler (UBLs) framstår som en dynamisk mobilnät signalering som reglerar olika biologiska banor inklusive hypoxi svar proteostasis, DNA-skador svar och transkription. För att bättre förstå hur UBLs reglerar vägar relevanta för mänskliga sjukdomar, har vi sammanställt en mänsklig siRNA "ubiquitome" bibliotek som består av 1,186 siRNA duplex pooler riktar alla kända och förutsedda komponenter i UBL systemet vägar. Detta bibliotek kan screenas mot ett antal cellinjer som uttrycker reportrar med olika biologiska reaktionsvägar för att bestämma vilka Ubl komponenter fungerar som positiva eller negativa regulatorer av vägen i fråga. Här beskriver vi ett protokoll som använder detta bibliotek för att identifiera ubiquitome-regulatorer av HIF1A förmedlade cellulära svaret på hypoxi med användning av en transkriptionsbaserad luciferas-reporter. En initial analys utvecklingsstadietutförs för att fastställa lämpliga screeningparametrar för cellinje innan du utför skärmen i tre stadier: primär, sekundär och tertiär / deconvolution screening. Användningen av riktade över hela bibliotek genom siRNA blir alltmer populärt eftersom det ger fördelen att rapportera endast om medlemmar av vägen med vilken utredarna är mest intresserade. Trots inneboende begränsningar av siRNA screening, särskilt falskt positiva som orsakas av siRNA ej åsyftade effekter, identifiering av äkta nya regulatorer av banorna i fråga uppväger dessa brister, som kan övervinnas genom att utföra en serie av noggrant genomförs kontrollexperiment.
Introduction
Modifiering av proteiner med ubiquitin och ubiquitin-liknande molekyler (UBLs) representerar en expansiv biokemiska system som reglerar olika biologiska vägar och stressreaktioner. Den kovalenta bindningen av UBLs till sina målproteiner kan ha olika utfall reglerar stabilitet, lokalisering, funktion eller interactome av substratet 1. De enzymatiska steg bakom UBL modifiering fastställdes första gången för ubiquitin, och nu fungerar som ett paradigm för modifiering med de flesta UBLs, inklusive SUMO, NEDD8, ISG15 och FAT10. För modifiering inträffa, är karboxylatgruppen i BV diglycin motivet först aktiveras av en E1 aktiverande enzym för att bilda en hög energi tiol som överförs till den aktiva plats cystein av en E2 konjugera enzym. Den E2 interagerar sedan med ett substrat-bundet E3 ligas att medla överföring i BV på (oftast) ett mål lysinenhet skapa en förgrenad kedja (isopeptide) länk 2. Successiva rundor av modifiering kan förekomma för att bygga isopeptide kedjor på substratet, vilket för ubikitin kan ske genom någon av dess sju lysiner eller via dess N-terminal metionin för att skapa linjära ubiquitin kedjor. Dessa modifieringar bildar diskreta topologier med olika syften såsom att skapa nya interaktions motiv och inriktning proteiner för nedbrytning före UBL borttagning av specialiserade proteaser. I fallet med ubikvitin finns två E1 enzymer, 30-40 E2 konjugera enzymer, åtminstone 600 E3-ligaser och cirka 100 deubiquitylating enzymer (DUBS). Även om banorna är mindre expansiv för de andra 10 eller så UBLs, ger den totala ubiquitome komplexitet enorm mångfald i den biologiska utfallet av en viss UBL modifiering. Men medan stora framsteg inom UBL biologi har gjorts, de exakta cellulära roller de flesta av dessa ubiquitome komponenter förblir okända.
Användningen av korta interfering ribonukleinsyra (siRNA) har vuxit fram som ett kraftfullt verktyg i omvänd genetik på grund av möjligheten av siRNA att särskilt inrikta cellulära mRNA för destruktion, vilket gör rollen av enskilda gener som skall undersökas i olika biologiska sammanhang 3. Hela genom skärmar har använts för att identifiera och validera nya regulatorer av många cellulära processer, och har skapat en uppsjö av användbara data tillgängliga för breda vetenskapliga kretsar. Men medan hela genom skärmar har visat sig extremt användbart, är riktade skärmar blir allt populärare eftersom de är billigare, snabbare, innebär mindre hantering och rapporten uppgifter endast om medlemmar i genomet där utredaren är mest intresserade. Därför, för att bättre förstå vilka cellulära processer ubl familje komponenter är involverade i, har vi sammanställt en människa siRNA bibliotek riktar alla kända och förutsedda komponenter i ubiquitome. Detta inkluderar UBLs, E1 aktiverande enzymer, E2 konjugerandeenzymer, E3-ligaser, ubiquitin-bindande domän (UBD)-innehållande proteiner och dubbar. Detta bibliotek kan användas för skydd mot ett brett spektrum av reporter cellinjer av distinkta biologiska problem, vilket gör det ideal identifiering av nya Ubl komponenter för dessa vägar.
Följande protokoll beskriver hur man utför en rigorös riktade siRNA ubiquitome skärmen för att identifiera nya regulatorer av HIF1A beroende svar på hypoxi. Vid normal syrespänning, är HIF1A föremål för prolyl hydroxylering som får den att kännas igen och riktade för nedbrytning av von Hippel Lindau (VHL) E3 ligas komplex 4. Hypoxi inhiberar prolyl hydroxylering som leder till en stabilisering av HIF1A och dess efterföljande bindning till hypoxisvarselement (HRES) för att driva genuttryck. Här beskriver vi en skärm med användning av U20S osteosarkomceller stabilt uttrycker luciferas från eldfluga under kontroll av tre tandemkopior av Hypoxia Response Element (U20S-HRE celler) 5. Detta protokoll kan anpassas för varje biologisk bana om en robust avläsning av reporter aktivitet är möjligt och kan kopplas med lämpliga positiva och negativa kontroller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Användningen av genomet hela siRNA skärmar i däggdjursceller har visat sig vara mycket värdefull för att identifiera nya regulatorer av olika biologiska banor. Här har vi beskrivit användningen av en riktad ubiquitome siRNA skärmen för att identifiera regulatorer av HIF1A förmedlade cellulära svaret på hypoxi. Riktade skärmarna blir alltmer attraktiva som de är i allmänhet billigare, snabbare, enklare att hantera och rapportera endast om de pathway komponenter där utredarna är intresserade 7, 10, 1…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Wellcome Trust, Glaxosmithkline (GSK) och det skotska institutet för Cell Signalling (nu en del av MRC proteinfosforylering och Ubiquitylation enhet).
Materials
| Automated Liquid Dispenser | Fluid-X | XPP-721 | http://www.fluidx.eu/BIOTRACK/xpp-721-liquid-handling-system.html |
| Automated cell counter | Nexcelom Bioscience | Cellometer Auto T4 | http://www.nexcelom.com/Cellometer-Auto-T4/index.html |
| Hypoxia Workstation | Ruskin | In vivo2 300 | http://www.ruskinn.com/products/invivo2300 |
| Automated Cell Dispenser | Thermo Scientific | Matrix Wellmate | http://www.matrixtechcorp.com/automated/pipetting.aspx?id=11 |
| Plate Shaker | Heidolph | Titramax 1000 | http://www.heidolph-instruments.co.uk/products/shakers-mixers/platform-shakers/vibrating/titramax/titramax-1000/ |
| Luminometer | Perkin Elmer | Envision 2104 Multilabel Reader | http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Family/ID/EnVision%20Multilabel%20Plate%20Readers |
| White Walled Assay Plate | Greiner Bio One | 655083 | http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/37_11/13221/ |
| Clear Plate Film | Perkin Elmer | 1450-461 | http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Product/ID/1450-461 |
| Name of the Reagent | |||
| siRNA library | Thermo Scientific | On-Target Plus | http://www.thermoscientificbio.com/rnai-and-custom-rna-synthesis/sirna/on-targetplus-sirna/search-gene/ |
| Transfection reagent | Invitrogen | Lipofectamine RNAimax | http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Transfection-Selection/lipofectamine-rnaimx.html |
| Reduced Serum Medium | Invitrogen | Optimem | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/31985062?ICID=search-product |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/41965039# |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-product# |
| Tryspin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product# |
References
- Hochstrasser, M. Origin and function of ubiquitin-like proteins. Nature. 458, 422-429 (2009).
- Schulman, B. A., Harper, J. W. Ubiquitin-like protein activation by E1 enzymes: the apex for downstream signalling pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 319-331 (2009).
- Siomi, H., Siomi, M. C. On the road to reading the RNA-interference code. Nature. 457, 396-404 (2009).
- Kaelin, W. G., Ratcliffe, P. J. Oxygen sensing by metazoans: the central role of the HIF hydroxylase pathway. Mol Cell. 30, 393-402 (2008).
- Melvin, A., Mudie, S., Rocha, S. The chromatin remodeler ISWI regulates the cellular response to hypoxia: role of FIH. Mol Biol Cell. 22, 4171-4181 (2011).
- Bhinder, B., Djaballah, H. A simple method for analyzing actives in random RNAi screens: introducing the "H Score" for hit nomination & gene prioritization. Comb Chem High Throughput Screen. 15, 686-704 (2012).
- Bett, J. S., et al. The P-body component USP52/PAN2 is a novel regulator of HIF1A mRNA stability. Biochem J. 451, 185-194 (2013).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).
- Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat Methods. 6, 569-575 (2009).
- Stagg, H. R., et al. The TRC8 E3 ligase ubiquitinates MHC class I molecules before dislocation from the ER. J Cell Biol. 186, 685-692 (2009).
- Zhang, Y., et al. RNF146 is a poly(ADP-ribose)-directed E3 ligase that regulates axin degradation and Wnt signalling. Nat Cell Biol. 13, 623-629 (2011).
- Jackson, A. L., et al. Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi. Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).
- Birmingham, A., et al. 3′ UTR seed matches, but not overall identity, are associated with RNAi off-targets. Nat Methods. 3, 199-204 (2006).
- . Whither RNAi. Nat Cell Biol. 5, 489-490 (2003).
