Microschaal-Vortex bijgestaan Electroporatie voor Sequential Molecular Delivery
Summary
Een microfluïdische vortex bijgestaan elektroporatie platform is ontwikkeld voor sequentiële levering van verschillende moleculen in dezelfde cel populaties met een nauwkeurige en onafhankelijke dosering controle. Het systeem afmeting gebaseerd doelcel zuiveringsstap voorgaande elektroporatie geholpen om moleculaire levering efficiëntie en verwerkt levensvatbaarheid van de cellen te verbeteren.
Abstract
Elektroporatie wordt steeds prominenter in de afgelopen jaren, omdat het een zeer krachtige techniek voor lichamelijk introduceren niet-doordringende exogene moleculaire probes in cellen. Dit werk meldt een microfluïdische elektroporatie platform in staat om meerdere molecuul levering aan zoogdiercellen met nauwkeurige en moleculair-afhankelijke parameter controle. Vermogen van het systeem om cellen te isoleren uniforme grootteverdeling maakt minder variatie in electroporatie efficiency per gegeven elektrische veldsterkte; vandaar verbeterde levensvatbaarheid monster. Bovendien zijn de werkwijze visualisatie functie maakt waarneming van de fluorescerende moleculaire opname in real-time, nopen moleculaire levering parameterinstellingen maakt in situ efficiëntieverbetering. Om de enorme mogelijkheden van de gerapporteerde platform laten zien, macromoleculen met verschillende afmetingen en elektrische ladingen (bijvoorbeeld dextran met MW van 3.000 en 70.000 Da) warengeleverd aan uitgezaaide borstkanker cellen met hoge levering efficiëntie (> 70%) voor alle geteste moleculen. De ontwikkelde platform heeft het potentieel aangetoond voor gebruik in de uitbreiding van onderzoeksgebieden waar on-chip elektroporatie technieken kunnen nuttig zijn.
Introduction
De laatste jaren heeft het gebruik van elektrische pulsen cytosolische levering van extracellulaire moleculen vergemakkelijkt een aantrekkelijke manier manipuleren zoogdiercellen. 1 Deze werkwijze, ook bekend als elektroporatie, omkeerbaar permeabilizes het celmembraan, waardoor inherent ondoorlaatbaar membraan moleculen toegang krijgen intracellulaire milieu van de cellen. Omdat vrijwel elk molecuul in het cytosol worden ingebracht via tijdelijke gemaakt poriën in het membraan van een type cellen middels elektroporatie wordt de techniek gemeld als meer reproduceerbaar en universeel, en efficiënter dan andere methoden die virus-gemedieerde chemische en optische benaderingen. 2-3 Deze techniek is gebruikt om fluorescerende moleculen te introduceren, 4 5 drugs en nucleïnezuren 6-7 terwijl cellen levensvatbaar en intact houden. Gezien deze voordelen is elektroporatie is aangenomen als een gemeenschappelijke arbeidAtory techniek voor DNA transfectie in vivo gentherapie 8 en celvaccinatie studies. Het is echter nog steeds moeilijk conventionele elektroporatie systemen tegelijk het praktische efficiëntie en levensvatbaar monsters met grote heterogeniteit in grootte omdat de elektrische veldsterkte vereist voor succesvolle elektroporatie nauw correleert met de diameter van de cel. Bovendien hoeft deze systemen niet mogelijk een nauwkeurige controle van de verschillende moleculaire verschuldigde bedragen te worden geleverd aan de afhankelijkheid van bulk stochastische moleculaire leveringsproces. 9 Om deze kwesties aan te pakken, hebben veel groepen microfluïdisch elektroporatie platforms ontwikkeld en biedt het voordeel van lagere poratie- spanningen, betere transfectie-efficiëntie, een grote reductie in celsterfte en mogelijkheid om meerdere moleculen te leveren. 10-13 Deze voordelen zijn mogelijk gemaakt door de kleine sporen van microschaal elektroporatie systemen waarvan elektroden veldlengtes zijn sub-millimeter, drastisch verminderen van spanningen die nodig zijn voor een succesvolle levering. Bovendien kunnen deze microschaal elektroporatie systemen uniform elektrisch veld distributie te bereiken en te snelle oplossing van opgewekte warmte, waardoor een verminderde sterfte cel terwijl het verbeteren van de levering efficiëntie. Het gebruik van transparante materialen voor deze microchips verder laat in situ observatie van de elektroporatie proces voor snelle verandering van een parameter. 2,12 Echter, nauwkeurige dosering controle en moleculair en cellulair-afhankelijke parameter controle, die nodig zijn voor de opkomende onderzoek en therapeutische toepassingen, 6, 14-16 nog steeds niet opgelost.
Dit werk geeft een microfluïdische vortex-geassisteerde elektroporatie systeem waarmee meerdere moleculen sequentieel in een vooraf geselecteerde identieke populatie van doelcellen. Cellen met uniforme grootteverdeling worden geïsoleerd voorafgaand aan elektroporatie met eerder gerapporteerde siZE-selectieve trapping mechanisme. 17-18 Door een uniforme grootte distributie, minder variatie in elektroporatie efficiëntie en een verbeterde leefbaarheid per gegeven elektrische veldsterkte werden bereikt. 19 Bovendien, voortdurend roeren gevangen cellen met behulp van microschaal wervels toegestaan voor uniforme levering van moleculen door de gehele cytosol, in overeenstemming met de eerder gerapporteerde resultaten een andere vortex-geassisteerde elektroporatie platform. 20 Om aan te tonen dat dit systeem voor een breed scala aan moleculen gewoonlijk gebruikt in biologische toepassingen zou zijn macromoleculen met een uitgebreide lijst van molecuulgewichten werden geleverd uitgezaaide borstkankercellen. Bovendien, met behulp van real-time proces monitoring, dit werk geeft meer bewijs om een einde tijdens electrporation maken aan de jarenlange discussie over het mechanisme van de moleculaire levering, het zijn voornamelijk elektroforese-gemedieerde versus-diffusie bemiddelde. 14 </sup> In tegenstelling tot andere systemen elektroporatie, dit platform biedt unieke de gecombineerde voordelen van nauwkeurige multi-molecule levering, hoogmoleculaire levering efficiency, minimaal celsterfte, een veelvoud aan afmetingen en kosten van geleverde moleculen en real-time visualisatie van de elektroporatie proces. Gezien deze mogelijkheden, de ontwikkelde elektroporatie systeem heeft praktische potentieel als een veelzijdig instrument voor cellulaire herprogrammering studies, 6,14,21-22 drug delivery toepassingen 10,19 en toepassingen die voor een diepgaande kennis van elektroporatie moleculaire levering mechanismen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Met de nieuwe parallelized elektroporatie platform, 10-voudige verhoging van de overslag en de efficiëntie van multi-molecuul aflevering werd in aanvulling op alle verdiensten die de eerder ontwikkelde single-kamer-systeem biedt bereikt. 18 Voorheen beschikbaar verdiensten omvatten (i) voorzuivering van doelcellen uniforme grootteverdeling levensvatbaarheid versterking, (ii) nauwkeurige en individuele moleculaire doseringssturing, en (iii) lage operationele elektrische stroom. Fluorescerend gemerkte dextrane…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door de Rowland Junior Fellow programma. De auteurs willen graag dankbaarheid aan de wetenschappers en medewerkers van het Instituut Rowland aan de Harvard uitdrukken: Chris Stokes voor zijn hulp bij de ontwikkeling van de custom-built, computerondersteunde drukregeling setup, Diane Schaak, Ph.D. voor haar input voor biologisch monster handling, Winfield Hill voor de ontwikkeling van de elektrische installatie, Alavaro Sanchez, Ph.D. voor het verlenen van toegang tot de flowcytometer, Scott Bevis, Kenny Spencer en Don Rogers voor de bewerking van mechanische onderdelen voor kranen die nodig zijn voor de druk setup. Microfluïdische meesters werden gefabriceerd bij het Center for Nanoscale Systems (CNS) aan de Harvard University.
Materials
| MDA-MB-231 cancer cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-26 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Cellgro, Mediatech, Inc. | 10-045-CV | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco, Life Technologies | 16000-044 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Cellgro, Mediatech, Inc. | 21-030 | |
| Trypsin | Gibco, Life Technologies | 25200-056 | |
| Flow Cytometer easyCyte HT | Millipore | 0500-4008 | |
| Oxygen Plasma Cleaner | Technics Micro-RIE | ||
| Dektak 6M surface profiler | Veeco | ||
| KMPR 1050 | Microchem | ||
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning | ||
| Compressed Nitrogen gas | Airgas | NI 300 | |
| High Pressure Regulator | McMaster-Carr | 6162K22 | |
| Downstream regulator | McMaster-Carr | 4000K563 | |
| high-speed 3/2way-8 valve manifold | Festo | ||
| Inline Check Valve | Idex Health and Science | CV3320 | |
| 5/32" OD x 3/32"ID Polyurethan tubes | Pneumadyne | PU-156F-0 | |
| 1/4" OD X 0.17" ID Polyurethan tubes | Pneumadyne | PU-250PB-4 | |
| 1/16" PEEK tubings | Festo | P1533 | |
| 1/32" PEEK tubings | Idex Health and Science | P1569 | |
| PEEK tubing unions | Idex Health and Science | P881 | |
| Pulse Generator | HP | 8110A | |
| Aluiminum Wire | Bob Martin Company | 6061 ALUM | |
| oscilloscope | Agilent | DSO3062A | |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 21008-178 | |
| 15 mL centrifuge tube | VWR | 21008-216 | |
| T75 culture flask | VWR | 82050-862 | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine, 3000 MW, Anionic | Gibco, Life Technologies | D3307 | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine, 70,000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D1819 | |
| Dextran, Texas Red, 3000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D3329 |
References
- Nakamura, H., Funahashi, J. Electroporation Past present and future. Dev Growth Diff. 55, 15-19 (2013).
- Geng, T., Lu, C. Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery. Lab Chip. 13, 3803-3821 (2013).
- Shahini, M., van Wijngaarden, F., Yeow, J. T. W. Fabrication of electro-microfluidic channel for single cell electroporation. Biomedical Microdevices. 15, 759-766 (2013).
- Neumann, E., Toensing, K., Kakorin, S., Budde, P., Frey, J. Mechanism of electroporative dye uptake by mouse B cells. Biophysical Journal. 74, 98-108 (1998).
- Jaroszeski, M. J., et al. Toxicity of anticancer agents mediated by electroporation in vitro. Anti-Cancer Drugs. 11, 201-208 (2000).
- Buntru, M., Gartner, S., Staib, L., Kreuzaler, F., Schlaich, N. Delivery of multiple transgenes to plant cells by an improved version of MultiRound Gateway technology. Transgenic Res. 22, 153-167 (2013).
- Mir, L. M., et al. High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4262-4267 (1999).
- Heller, R., et al. Intradermal delivery of interleukin-12 plasmid DNA by in vivo electroporation. DNA Cell Biol. 20, 381-381 (2001).
- Boukany, P. E., et al. Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells. Nat Nanotechnol. 6, 747-754 (2011).
- Wang, J., et al. Synergistic Effects of Nanosecond Pulsed Electric Fields Combined with Low Concentration of Gemcitabine on Human Oral Squamous Cell Carcinoma. In Vitro PLoS One. 7, (2012).
- Kim, M. J., Kim, T., Cho, Y. H. Cell electroporation chip using multiple electric field zones in a single channel. Appl Phys Lett. 101, (2012).
- Wang, S. N., Lee, L. J. Micro-/nanofluidics based cell electroporation. Biomicrofluidics. 7, (2013).
- Sharei, A., et al. A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery. Proc. Natl Acad Sci USA. 110, 2082-2087 (2013).
- Kim, J. B., et al. Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4. Nature. 461, U649-U693 (2009).
- Ozbas-Turan, S., Aral, C., Kabasakal, L., Keyer-Uysal, M., Akbuga, J. Co-encapsulation of two plasmids in chitosan microspheres as a non-viral gene delivery vehicle. J Pharm Pharm Sci. 6, 27-32 (2003).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, U311-U313 (2007).
- Hur, S. C., Mach, A. J., Di Carlo, D. High-throughput size-based rare cell enrichment using microscale vortices. Biomicrofluidics. 5, (2011).
- Yun, H. Y., Hur, S. C. Sequential multi-molecule delivery using vortex-assisted electroporation. Lab Chip. 13, 2764-2772 (2013).
- Gehl, J. Electroporation theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiol Scand. 177, 437-447 (2003).
- Wang, J., Zhan, Y. H., Ugaz, V. M., Lu, C. Vortex-assisted DNA delivery. Lab Chip. 10, 2057-2061 (2010).
- Jia, F. J., et al. A nonviral minicircle vector for deriving human iPS cells. Nature Methods. 7, U146-U197 (2010).
- Dunbar, C. E. Gene transfer to hematopoietic stem cells Implications for gene therapy of human disease. Annual Review of Medicine. 47, 11-20 (1996).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angew Chem-Int Edit. 37, 551-575 (1998).
- Graziadei, L., Burfeind, P., Barsagi, D. Introduction of Unlabeled Proteins into Living Cells by Electroporation and Isolation of Viable Protein-Loaded Cells Using Dextran Fluorescein Isothiocyanate as a Marker for Protein-Uptake. Anal Biochem. 194, 198-203 (1991).
- Dimitrov, D. S., Sowers, A. E. Membrane Electroporation-Fast Molecular-Exchange by Electroosmosis. Biochimica Et Biophysica Acta. 1022, 381-392 (1990).
- Sukharev, S. I., Klenchin, V. A., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev Yu, A. Electroporation and electrophoretic DNA transfer into cells. The effect of DNA interaction with electropores. Biophysical Journal. 63, 1320-1327 (1992).
- Glogauer, M., McCulloch, C. A. G. Introduction of large molecules into viable fibroblasts by electroporation Optimization of loading and identification of labeled cellular compartments. Experimental Cell Research. 200, 227-234 (1992).
- Verspohl, E. J., KaiserlingBuddemeier, I., Wienecke, A. Introducing specific antibodies into electropermeabilized cells is a valuable tool for eliminating specific cell functions. Cell Biochemistry and Function. 15, 127-134 (1997).
