マイクロスケール渦アシストシーケンシャル分子送達用エレクトロポ
Summary
マイクロ流体渦補助エレクトロポレーション·プラットフォームは、正確かつ独立した投与量制御を備えた同一の細胞集団への複数の分子の順次配信のために開発されました。分子の送達効率および加工細胞の生存率を向上させるために支援エレクトロポレーションの前に、システムのサイズベースの標的細胞精製工程。
Abstract
それは物理的に細胞内に非浸透性の外因性分子プローブを導入するための非常に強力な技術であるため、エレクトロポレーションは、過去数年間でますます注目を受けている。この作品は、精密な分子に依存するパラメータ制御で、哺乳動物細胞への複数の分子送達を行うことが可能なマイクロ流体電気穿孔プラットフォームを報告します。均一なサイズ分布を有する細胞を単離するシステムの能力は、与えられた電界強度あたりのエレクトロポレーション効率のより少ない変動を可能にする;したがって、サンプルの生存率を高めた。また、そのプロセスの可視化機能は、効率向上のために、その場で迅速な分子デリバリーパラメータ調整を可能にする、リアルタイムで蛍光分子の取り込み過程を観察することができます。報告されたプラットフォームの膨大な機能を表示するには、異なるサイズおよび電荷（3,000 70,000 DaでMWを有する、例えばデキストラン）を持つ巨大分子であったすべての試験した分子に対して高い送達効率（> 70％）で転移性乳癌細胞に送達する。開発プラットフォームは、オンチップエレクトロポレーション技術は有益である研究分野の拡大に使用するための可能性を証明した。
Introduction
近年では、細胞外分子のサイトゾル送達を容易にするために、電気パルスの使用は、哺乳動物細胞を操作する魅力的な手段となっている。1もエレクトロポレーションと呼ばれるこのプロセスは、可逆的にアクセスするために、本 質的に膜不透過性分子を可能にする、細胞膜を透過性に細胞の細胞内環境に。実質的に任意の分子がエレクトロポレーションを用いた細胞の任意のタイプの膜に一時的に作成細孔を介してサイトゾルに導入することができ、この技術はより再現性であると報告されており、普遍的に適用、およびウイルス媒介化学を含む他の方法よりも効率的であるため細胞が生存し、そのまま保ちながら光学的ア プローチ2-3この技術は、蛍光分子を導入する4医薬品5および核酸6-7利用されている。これらの利点を考えると、エレクトロポレーションは、一般的な労働力として採用されているDNAトランスフェクションのためのatory技術、 インビボ遺伝子治療8および細胞ワクチン接種の研究。成功したエレクトロポレーションに必要な電界強度が密接に細胞の直径と相関するので、従来のエレクトロポレーションシステムは、同時に、サイズが大きな不均一性を有するサンプルのための実用的な効率および生存率を達成することは依然としては困難である。さらに、これらのシステムは、複数の分子量の正確な制御は、バルク確率的分子送達プロセスへの依存に起因して配信されることはできない。9にこれらの問題に対処するために、多くのグループが、より低いポレーション電圧の利点を提供する、マイクロ流体エレクトロポレーション·プラットフォームを開発したより良いトランスフェクション効率、細胞死亡率の大幅な削減、および複数の分子を送達する能力。10〜13これらの利点は、電極ピッチマイクロエレクトロポレーションシステムの小さなフットプリントにより可能となった長さは飛躍的に成功した配信のために必要な電圧を減少させ、サブミリメートルである。さらに、これらのマイクロエレクトロポレーションシステムは、均一な電界分布を得ることができ、迅速に送達効率を高めつつ、縮小細胞死を生じ、発生した熱を放散する。これらのマイクロチップのための透明な材料を利用し、さらに迅速なパラメータ変更のためのエレクトロポレーションプロセスのその場観察ができます。2,12しかし、投与量の制御とmolecular-と携帯依存のパラメータ制御の正確な新興研究および治療 用途のために必要、6、 14-16は依然として未解決のまま。
この研究は、標的細胞の予め選択された同一集団に順次複数の分子を送達することができるマイクロ流体渦アシストエレクトロポレーションシステムを提示する。均一なサイズ分布を有する細胞は、以前に報告されたSiを用いたエレクトロポレーションの前に単離されるぜ選択的捕捉機構。17-18与えられた電界強度あたりのエレクトロポレーションの効率および拡張生存率の小さい変化が達成された、均一なサイズ分布を有することにより、 図19さらに、連続的に横切る分子の均一な送達のために許可されたマイクロスケールの渦を用いて捕捉された細胞を撹拌結果と一致する全体細胞質ゾルは、以前に別の渦アシストエレクトロポレーションプラットフォームを使用して報告した。20このシステムは広範囲の分子量を有する巨大分子をに配信された、一般的に生物学的用途で利用される分子の広い範囲に適用可能であることを示すために転移性乳癌細胞。また、リアルタイムのプロセス監視の助けを借りて、この作品はelectrporation中の分子配信のメカニズムについての長年の論争に終止符を打つためのより多くの証拠を提供し、主に拡散媒介対電気泳動媒介されている。14 </sup>他のエレクトロポレーションシステムとは異なり、このプラットフォームは、一意的に正確なマルチ分子送達、高分子送達効率、最小の細胞死、サイズ、送達分子の電荷の広いスパン、ならびにエレクトロポレーションのリアルタイム可視化を組み合わせた利点を提供するプロセス。これらの機能を考えると、開発したエレクトロポレーションシステムは、セルラーリプログラミング研究、6,14,21-22薬物送達用途10,19およびエレクトロ分子配信メカニズムの深い理解のために必要とするアプリケーションのための汎用ツールとして実用的な可能性を秘めています。
Protocol
Representative Results
Discussion
スループットおよび多分子送達の効率の新しい並列化エレクトロポレーションプラットフォーム、10倍の増強に以前に開発単室システムが提供する全ての利点に加えて、達成された。18以前は利用可能なメリットは、（i）予備精製が含まれる生存能力増強のための均一なサイズ分布、（ii）の正確かつ個別分子の投薬管理、および（iii）低い運用電流を有する細胞を標的とする。これ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、ローランドジュニア·フェロー· プログラムによってサポートされています。クリス·ストークス特注の、コンピュータ支援圧力制御のセットアップ博士ダイアンSchaak、の開発に彼の助けのため：著者はハーバード大学ローランド研究所の科学者やスタッフに感謝の意を表したいと思います生体試料処理のための彼女の入力、電気セットアップを開発するためのウィンフィールド·ヒル、Alavaroサンチェス博士のための圧力のセットアップに必要な機械の配管部品を機械加工するためのフローサイトメーター、スコットBevis、ケニースペンサーとドンロジャースへのアクセスを許可する。マイクロ流体のマスターは、ハーバード大学のナノスケールシステムセンター（CNS）で作製した。
Materials
| MDA-MB-231 cancer cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-26 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Cellgro, Mediatech, Inc. | 10-045-CV | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco, Life Technologies | 16000-044 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Cellgro, Mediatech, Inc. | 21-030 | |
| Trypsin | Gibco, Life Technologies | 25200-056 | |
| Flow Cytometer easyCyte HT | Millipore | 0500-4008 | |
| Oxygen Plasma Cleaner | Technics Micro-RIE | ||
| Dektak 6M surface profiler | Veeco | ||
| KMPR 1050 | Microchem | ||
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning | ||
| Compressed Nitrogen gas | Airgas | NI 300 | |
| High Pressure Regulator | McMaster-Carr | 6162K22 | |
| Downstream regulator | McMaster-Carr | 4000K563 | |
| high-speed 3/2way-8 valve manifold | Festo | ||
| Inline Check Valve | Idex Health and Science | CV3320 | |
| 5/32" OD x 3/32"ID Polyurethan tubes | Pneumadyne | PU-156F-0 | |
| 1/4" OD X 0.17" ID Polyurethan tubes | Pneumadyne | PU-250PB-4 | |
| 1/16" PEEK tubings | Festo | P1533 | |
| 1/32" PEEK tubings | Idex Health and Science | P1569 | |
| PEEK tubing unions | Idex Health and Science | P881 | |
| Pulse Generator | HP | 8110A | |
| Aluiminum Wire | Bob Martin Company | 6061 ALUM | |
| oscilloscope | Agilent | DSO3062A | |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 21008-178 | |
| 15 mL centrifuge tube | VWR | 21008-216 | |
| T75 culture flask | VWR | 82050-862 | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine, 3000 MW, Anionic | Gibco, Life Technologies | D3307 | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine, 70,000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D1819 | |
| Dextran, Texas Red, 3000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D3329 |
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