Microscale Vortex destekli Sıralı Moleküler Teslimat için Electroporator
Summary
Bir mikro-akışkan girdap eliyle elektroporasyon platformu kesin dozaj ve bağımsız kontrolü ile aynı hücre popülasyonlarına dağılımını çok sayıda molekülün ardışık olarak verilmesi için geliştirilmiştir. Sistemin büyüklüğü göre hedef hücre saflaştırma adımı önceki elektroporasyon moleküler verme etkinliğini ve işlenmiş hücre canlılığı arttırmak için destekli.
Abstract
Fiziksel hücrelerine olmayan geçirgenler dışsal moleküler problar tanıtmak için çok güçlü bir tekniktir çünkü elektroporasyon, geçmiş yıllarda artan ilgi görmüştür. Bu çalışma, hassas ve moleküler bağlı bir parametre kontrol memeli hücreleri için birden fazla molekül teslimat gerçekleştirebilen bir mikroakışkan elektroporasyon platformu bildirir. Üniform bir boyut dağılımı ile hücreleri izole etmek için etme kabiliyeti verilen elektrik alanı gücüne göre elektroporasyon verimlilikte az varyasyona izin verir; Bu nedenle örnek canlılığı artırmıştır. Dahası, bu süreç de görselleştirme özelliği verimliliğin arttırılması için in situ moleküler hızlı teslimat parametre ayarlaması izin gerçek zamanlı flüoresan molekül alım işlemi, gözlem için izin verir. Bildirilen platformunun geniş yeteneklerini göstermek için, farklı boyutlarda ve elektrik ücretleri ile Macromolecules (örneğin, Dextran'ın 3.000 ve 70.000 Da MW ile) vardıtest edilen tüm molekülleri için yüksek bir uygulama randımanı (>% 70) ile metastatik meme kanserli hücrelere verilebilir. Geliştirilen platform-chip elektroporasyon teknikleri yararlı olabilir araştırma alanları genişleme kullanım potansiyelini kanıtlamıştır.
Introduction
Son yıllarda, hücre dışı molekülleri sitosolik sağlanmasının kolaylaştırılması için elektrik darbeleri kullanımı memeli hücreleri manipüle çekici bir araç haline gelmiştir. 1 ayrıca elektroporasyon gibi bilinen bu yöntem, tersine çevrilebilir şekilde erişim elde etmek için doğal olarak zarın geçirgen moleküller sağlayan, hücresel membran permeabilizes hücrelerin hücre içi muhitine. Hemen hemen herhangi bir molekül, elektroporasyon kullanılarak hücre herhangi bir tip membran geçici oluşturulan gözenekler yoluyla sitosol içine sokulabilir için, teknik olarak rapor edilmiş olan, daha fazla tekrarlanabilir evrensel olarak uygulanabilir, ve virüs aracılı, kimyasal mekanizmayı da içeren diğer yöntemlere göre daha verimli Hücreler, canlı ve sağlam tutarken ve optik yaklaşımlar. 2-3 Bu teknik, floresan molekülleri yerleştirilebilir 4 ilaçlar 5 ve nükleik asitler 6-7 kullanılmıştır. Bu faydaları göz önüne alındığında, elektroporasyon ortak emek olarak kabul edilmiştirDNA, transfeksiyonu için atory teknik, in vivo gen terapisi 8 ve hücre aşı çalışmaları. Başarılı elektroporasyon için gerekli olan elektrik alan gücü yakından hücrenin çapı ilişkilidir, çünkü geleneksel elektroporasyon sistemleri aynı zamanda boyut olarak büyük heterojenlikleriyle bu numuneler için pratik etkinlik ve canlılığı elde etmek için olması, yine de, zordur. Ayrıca, bu sistemlerin çoklu moleküler miktarlarda hassas kontrolü toplu Stokastik moleküler teslimat sürecinde güven nedeniyle teslim izin vermez. 9 bu sorunları ele almak için bir çok grup, alt gözeneklendirmenin gerilimlerinin avantajı sunan, mikrofluidik elektroporasyon platformları geliştirdik Daha iyi transfeksiyon verimi, hücre ölüm oranlarında önemli bir azalma ve çoklu molekülleri iletme kabiliyeti. 10-13 Bu avantajlar, elektrot aralığı olan mikro elektro sistemleri az yer kaplayan sayesinde mümkün olmuşturuzunlukları ölçüde başarılı teslimat için gerekli gerilimleri azalan, alt milimetre. Ayrıca, bu mikro elektroporasyon sistemler dağıtım verimliliğini artırırken, indirgenmiş hücre ölümlerini, sonuçta üretilen ısıyı hızla homojen bir elektrik alan dağılımı elde edebilir. Ayrıca bu mikroçipler için şeffaf malzeme kullanımı istemi parametre değişiklikleri için elektroporasyon işleminin yerinde gözlem sağlar. 2,12 Ancak, hassas dozaj kontrolü ve araştırma ve tedavi uygulamaları, 6 gelişmekte için gerekli moleküllü ve hücresel-bağımlı parametre kontrolü, 14-16 hala çözülmemiş kalır.
Bu çalışma, ardışık olarak, hedef hücrelerin önceden seçilmiş aynı popülasyonu içine çok molekül verme yetisine sahip bir mikroakışkan girdap destekli elektroporasyon sistemi sunar. Üniform bir boyut dağılımı olan hücreler, daha önce rapor si kullanılarak Elektroporasyondan önce izole edilirze-seçici yakalama mekanizması. 17-18 bir üniform bir boyut dağılımı, daha az değişim elektroporasyon verimlilikte elde edildi ve belirli bir elektrik alanı gücüne göre geliştirilmiş canlılığı sahip olarak. 19 Bundan başka, sürekli mikro girdapları kullanılarak yakalanan hücrelerin ajite boyunca moleküllerin homojen dağılımı için bırakıldı sonuçları ile uyum içindedir bütün sitosol, daha önce, bu sistem, genel olarak, biyolojik uygulamalarda, molekül, geniş bir aralığına uygulanabilirdir olacağını saptamak. bir girdap destekli platform kullanılarak elektroporasyon 20 bilgi teslim edilmiştir molekül ağırlıkları çok geniş bir yelpazede olan makro moleküller metastatik meme kanseri hücreleridir. Ayrıca, gerçek zamanlı süreç izleme yardımı ile, bu iş ağırlıklı olarak difüzyon-aracılı. 14 karşı elektroforezi-aracılı olmak, electrporation sırasında moleküler teslim mekanizması ile ilgili uzun süredir tartışmalara bir son vermek için daha fazla kanıt sağlar </sup> Diğer elektroporasyon sistemlerden farklı olarak, bu platform benzersiz elektroporasyon hassas çok moleküllü teslimat, yüksek moleküler temin verimi, en az hücre ölüm oranı, boyutu ve teslim moleküllerin ücretler geniş bir açıklık, hem de gerçek zamanlı görsel kombine avantaj sağlamaktadır süreci. Bu yetenekleri göz önüne alındığında, geliştirilen elektroporasyon sistemi elektroporasyon moleküler dağıtım mekanizmalarını derinlemesine anlaşılması için gerektiren hücresel yeniden programlama çalışmaları, 6,14,21-22 ilaç dağıtım uygulamaları 10,19 ve uygulamalar için çok yönlü bir araç olarak pratik bir potansiyele sahiptir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Verim ve çoklu teslimat molekül verimlilikte yeni paralelleştirilmiş elektroporasyon platformu 10 kat geliştirilmesi ile, daha önce geliştirilmiş tek odacıklı sistem sağladığı tüm yararları ek olarak elde edildi. 18 Daha önce hazır yararları: (i) ön-arıtılması canlılık geliştirme için üniform bir boyut dağılımı, (ii) tam bir dozaj ve ayrı ayrı moleküler kontrol ve (iii) düşük işletme elektrik akımı ile hedef hücrelere. Bu molekül ağırlıkları, konjuge florofor tü…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Rowland Yeni Fellow programı tarafından desteklenmektedir. Chris Stokes özel yapılmış, bilgisayar destekli basınç kontrolü kurulumu, Ph.D. Diane Schaak, gelişmesinde yaptığı yardım için: Yazarlar Harvard'da Rowland Enstitüsü bilim adamları ve personel için minnettarlığını ifade etmek istiyorum biyolojik numune taşıma için onun girişi için, Winfield Tepesi için elektrik kurulumu, Ph.D. Alavaro Sanchez, gelişmekte Basınç kurulumu için gerekli mekanik tesisat bileşenleri işlemek için sitometrede akış, Scott Bevis, Kenny Spencer ve Don Rogers erişim verilmesi için. Mikroakışkan ustaları Harvard Üniversitesi'nde Nano Sistemleri Merkezi (MSS) de imal edildi.
Materials
| MDA-MB-231 cancer cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-26 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Cellgro, Mediatech, Inc. | 10-045-CV | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco, Life Technologies | 16000-044 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Cellgro, Mediatech, Inc. | 21-030 | |
| Trypsin | Gibco, Life Technologies | 25200-056 | |
| Flow Cytometer easyCyte HT | Millipore | 0500-4008 | |
| Oxygen Plasma Cleaner | Technics Micro-RIE | ||
| Dektak 6M surface profiler | Veeco | ||
| KMPR 1050 | Microchem | ||
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning | ||
| Compressed Nitrogen gas | Airgas | NI 300 | |
| High Pressure Regulator | McMaster-Carr | 6162K22 | |
| Downstream regulator | McMaster-Carr | 4000K563 | |
| high-speed 3/2way-8 valve manifold | Festo | ||
| Inline Check Valve | Idex Health and Science | CV3320 | |
| 5/32" OD x 3/32"ID Polyurethan tubes | Pneumadyne | PU-156F-0 | |
| 1/4" OD X 0.17" ID Polyurethan tubes | Pneumadyne | PU-250PB-4 | |
| 1/16" PEEK tubings | Festo | P1533 | |
| 1/32" PEEK tubings | Idex Health and Science | P1569 | |
| PEEK tubing unions | Idex Health and Science | P881 | |
| Pulse Generator | HP | 8110A | |
| Aluiminum Wire | Bob Martin Company | 6061 ALUM | |
| oscilloscope | Agilent | DSO3062A | |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 21008-178 | |
| 15 mL centrifuge tube | VWR | 21008-216 | |
| T75 culture flask | VWR | 82050-862 | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine, 3000 MW, Anionic | Gibco, Life Technologies | D3307 | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine, 70,000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D1819 | |
| Dextran, Texas Red, 3000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D3329 |
References
- Nakamura, H., Funahashi, J. Electroporation Past present and future. Dev Growth Diff. 55, 15-19 (2013).
- Geng, T., Lu, C. Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery. Lab Chip. 13, 3803-3821 (2013).
- Shahini, M., van Wijngaarden, F., Yeow, J. T. W. Fabrication of electro-microfluidic channel for single cell electroporation. Biomedical Microdevices. 15, 759-766 (2013).
- Neumann, E., Toensing, K., Kakorin, S., Budde, P., Frey, J. Mechanism of electroporative dye uptake by mouse B cells. Biophysical Journal. 74, 98-108 (1998).
- Jaroszeski, M. J., et al. Toxicity of anticancer agents mediated by electroporation in vitro. Anti-Cancer Drugs. 11, 201-208 (2000).
- Buntru, M., Gartner, S., Staib, L., Kreuzaler, F., Schlaich, N. Delivery of multiple transgenes to plant cells by an improved version of MultiRound Gateway technology. Transgenic Res. 22, 153-167 (2013).
- Mir, L. M., et al. High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4262-4267 (1999).
- Heller, R., et al. Intradermal delivery of interleukin-12 plasmid DNA by in vivo electroporation. DNA Cell Biol. 20, 381-381 (2001).
- Boukany, P. E., et al. Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells. Nat Nanotechnol. 6, 747-754 (2011).
- Wang, J., et al. Synergistic Effects of Nanosecond Pulsed Electric Fields Combined with Low Concentration of Gemcitabine on Human Oral Squamous Cell Carcinoma. In Vitro PLoS One. 7, (2012).
- Kim, M. J., Kim, T., Cho, Y. H. Cell electroporation chip using multiple electric field zones in a single channel. Appl Phys Lett. 101, (2012).
- Wang, S. N., Lee, L. J. Micro-/nanofluidics based cell electroporation. Biomicrofluidics. 7, (2013).
- Sharei, A., et al. A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery. Proc. Natl Acad Sci USA. 110, 2082-2087 (2013).
- Kim, J. B., et al. Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4. Nature. 461, U649-U693 (2009).
- Ozbas-Turan, S., Aral, C., Kabasakal, L., Keyer-Uysal, M., Akbuga, J. Co-encapsulation of two plasmids in chitosan microspheres as a non-viral gene delivery vehicle. J Pharm Pharm Sci. 6, 27-32 (2003).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, U311-U313 (2007).
- Hur, S. C., Mach, A. J., Di Carlo, D. High-throughput size-based rare cell enrichment using microscale vortices. Biomicrofluidics. 5, (2011).
- Yun, H. Y., Hur, S. C. Sequential multi-molecule delivery using vortex-assisted electroporation. Lab Chip. 13, 2764-2772 (2013).
- Gehl, J. Electroporation theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiol Scand. 177, 437-447 (2003).
- Wang, J., Zhan, Y. H., Ugaz, V. M., Lu, C. Vortex-assisted DNA delivery. Lab Chip. 10, 2057-2061 (2010).
- Jia, F. J., et al. A nonviral minicircle vector for deriving human iPS cells. Nature Methods. 7, U146-U197 (2010).
- Dunbar, C. E. Gene transfer to hematopoietic stem cells Implications for gene therapy of human disease. Annual Review of Medicine. 47, 11-20 (1996).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angew Chem-Int Edit. 37, 551-575 (1998).
- Graziadei, L., Burfeind, P., Barsagi, D. Introduction of Unlabeled Proteins into Living Cells by Electroporation and Isolation of Viable Protein-Loaded Cells Using Dextran Fluorescein Isothiocyanate as a Marker for Protein-Uptake. Anal Biochem. 194, 198-203 (1991).
- Dimitrov, D. S., Sowers, A. E. Membrane Electroporation-Fast Molecular-Exchange by Electroosmosis. Biochimica Et Biophysica Acta. 1022, 381-392 (1990).
- Sukharev, S. I., Klenchin, V. A., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev Yu, A. Electroporation and electrophoretic DNA transfer into cells. The effect of DNA interaction with electropores. Biophysical Journal. 63, 1320-1327 (1992).
- Glogauer, M., McCulloch, C. A. G. Introduction of large molecules into viable fibroblasts by electroporation Optimization of loading and identification of labeled cellular compartments. Experimental Cell Research. 200, 227-234 (1992).
- Verspohl, E. J., KaiserlingBuddemeier, I., Wienecke, A. Introducing specific antibodies into electropermeabilized cells is a valuable tool for eliminating specific cell functions. Cell Biochemistry and Function. 15, 127-134 (1997).
