Микромасштабные Vortex-помощь электропоратора для последовательного молекулярной Доставка
Summary
Микрожидкостных вихрь помощь электропорации платформа была разработана для последовательного осуществления различных молекул в одинаковых клеточных популяций с точным и независимой лекарственной контроля. Размер основе стадия очистки клетки-мишени, предшествующий электропорации системы автоматизированного чтобы добавлять на молекулярную эффективность доставки и обработанную жизнеспособность клеток.
Abstract
Электропорация уделяется все больше внимания в последние годы, потому что это очень мощная техника для физически введения не-проникающего экзогенных молекулярных зондов в клетках. Эта работа сообщает микрофлюидном электропорации платформу, способную творить доставку несколько молекул в клетках млекопитающих с точным и молекулярно-зависимого управления параметрами. Способность системы изолировать клетки с равномерным распределением по размерам позволяет за меньшие изменения в эффективности электропорации в данной напряженности электрического поля; следовательно усиливается жизнеспособность образца. Кроме того, его функция визуализации процесса позволяет для наблюдения флуоресцентного молекулярного процесса поглощения в режиме реального времени, что позволяет оперативно коррективы молекулярных параметров поставки на месте для повышения эффективности. Чтобы показать обширные возможности отчетном платформы, макромолекулы с различными размерами и электрических зарядов (например, декстран с молекулярной массой 3000 и 70000 Da) былидоставлены в метастатических клеток рака молочной железы с КПД высокий доставки (> 70%) для всех тестируемых молекул. Разработанная платформа доказала свой потенциал для использования в разложении областях исследований, где на чипе методы электропорации может быть выгодно.
Introduction
В последние годы использование электрических импульсов, чтобы облегчить доставку цитозольного внеклеточных молекул стал привлекательным средством манипулирования клеток млекопитающих. 1 Этот процесс, известный также как электропорация, обратимо permeabilizes клеточной мембраны, что позволяет по своей природе мембран молекул непроницаемых, чтобы получить доступ к внутриклеточной среде клетки. Поскольку практически любую молекулу могут быть введены в цитозоле с помощью временных созданных поры в мембране любого типа клеток с использованием электропорации, техника сообщалось как более воспроизводимым, универсально применимыми, и более эффективным, чем другие методы, включая вирус-опосредованной, химической и оптические подходы. 2-3 Эта техника была использована для введения флуоресцентных молекул, 4 наркотики 5 и нуклеиновых кислот 6-7, сохраняя клетки жизнеспособны и нетронутыми. Учитывая эти преимущества, электропорации был принят в качестве общего трудаТехника Atory для трансфекции ДНК, в естественных условиях генной терапии 8 и исследования вакцинации клеток. Это, однако, все еще трудно обычные системы электропорации одновременно достичь практическую эффективность и жизнеспособность для образцов с большой неоднородности в размере, потому что напряженность электрического поля, необходимые для успешного электропорации тесно коррелирует с диаметром ячейки. Кроме того, эти системы не позволяют точное управление из нескольких молекулярных количествах поставляются в связи с зависимостью от объемной стохастических молекулярных процесса доставки. 9 В целях решения этих проблем, многие группы разработали микрофлюидных платформы электропорации, дает преимущество более низких напряжениях порации, лучше эффективность трансфекции, значительное снижение клеток смертности, и способность доставлять несколько молекул. 10-13 Эти преимущества стали возможными благодаря малых следы микромасштабных систем электропорации, чьи электрод шагдлины суб-миллиметров, резко уменьшая напряжения, необходимые для успешной реализации. Кроме того, эти микромасштабные системы электропорации можно добиться равномерного распределения электрического поля и быстро рассеивается выделяемое тепло, уступая снижением смертности клеток, повысить эффективность доставки. Использование прозрачных материалов для этих микрочипов дальнейших позволяет на месте наблюдения за процессом электропорации для быстрых изменений параметров. 2,12 Однако, точный контроль дозировки и молекулярно-и сотовой зависит от контроля параметров, необходимых для новых исследований и терапевтических приложений, 6, 14-16 все еще остаются нерешенными.
Эта работа представляет собой микрофлюидных вихревую-помощь электропорации систему, способную доставлять несколько молекул последовательно в заранее выбранном одинаковой населения клеток-мишеней. Клетки с равномерного распределения размера изолированы до электропорации с использованием сообщалось ранее сиге-селективный механизм захвата. 17-18 Имея однородное распределение по размеру, меньше отклонений в эффективности электропорации и повышенную жизнеспособность за данной напряженности электрического поля были достигнуты. 19 Кроме того, постоянно агитирует захваченных клеток с использованием микромасштабной вихри разрешено для равномерного доставки молекул через Весь цитозоле, в соответствии с результатами ранее сообщалось, с использованием другого вихревого при содействии электропорации платформу. 20, чтобы продемонстрировать, что эта система будет применяться для широкого диапазона молекул, обычно используемых в биологических приложений, макромолекул с широким диапазоном молекулярных масс были доставлены метастатических клеток рака молочной железы. Кроме того, с помощью мониторинга процесса в режиме реального времени, эта работа дает больше доказательств, чтобы положить конец долгой стоячей дискуссии относительно механизма молекулярной доставкой в electrporation, будучи преимущественно электрофорез опосредованного против диффузии опосредованной. 14 </sup> В отличие от других систем электропорации, эта платформа однозначно предоставляет объединенные преимущества доставки точного нескольких молекул, высокой эффективности молекулярной поставки, минимальной смертности клеток, в широком диапазоне размеров и зарядов поставляемых молекул, а также в режиме реального времени визуализации электропорации процесс. Учитывая эти возможности, развитая система электропорации имеет практический потенциал как универсальный инструмент для сотовой перепрограммирования исследований, приложений 6,14,21-22 наркотиков доставки 10,19 и приложений, требующих для углубленного понимания электропорации механизмов молекулярных доставки.
Protocol
Representative Results
Discussion
С новым распараллелить электропорации платформы, повышение в 10 раз в пропускной способности и эффективности системы оказания мульти-молекулы была достигнута в дополнение ко всем достоинствам, которые обеспечивает ранее разработанная система однокамерный. +18 Ранее доступные за…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа выполнена в рамках программы Rowland Младший научный сотрудник. Авторы хотели бы выразить благодарность ученых и сотрудников на Rowland института в Гарварде: Крис Стоукс за помощь в развитии заказного, настройки управления давлением с помощью компьютера, Диана Schaak, кандидат для ее ввода для биологической обработки проб, Уинфилд Хилл за разработку электрической установки, Alavaro Санчес, кандидат для предоставления доступа к проточной цитометрии, Скотт Bevis, Кенни Спенсера и Дон Роджерс для обработки механических компонентов сантехника, необходимых для настройки давления. Микрожидкостных мастера были изготовлены в Центре наноразмерных систем (ЦНС) в Гарвардском университете.
Materials
| MDA-MB-231 cancer cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-26 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Cellgro, Mediatech, Inc. | 10-045-CV | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco, Life Technologies | 16000-044 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Cellgro, Mediatech, Inc. | 21-030 | |
| Trypsin | Gibco, Life Technologies | 25200-056 | |
| Flow Cytometer easyCyte HT | Millipore | 0500-4008 | |
| Oxygen Plasma Cleaner | Technics Micro-RIE | ||
| Dektak 6M surface profiler | Veeco | ||
| KMPR 1050 | Microchem | ||
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning | ||
| Compressed Nitrogen gas | Airgas | NI 300 | |
| High Pressure Regulator | McMaster-Carr | 6162K22 | |
| Downstream regulator | McMaster-Carr | 4000K563 | |
| high-speed 3/2way-8 valve manifold | Festo | ||
| Inline Check Valve | Idex Health and Science | CV3320 | |
| 5/32" OD x 3/32"ID Polyurethan tubes | Pneumadyne | PU-156F-0 | |
| 1/4" OD X 0.17" ID Polyurethan tubes | Pneumadyne | PU-250PB-4 | |
| 1/16" PEEK tubings | Festo | P1533 | |
| 1/32" PEEK tubings | Idex Health and Science | P1569 | |
| PEEK tubing unions | Idex Health and Science | P881 | |
| Pulse Generator | HP | 8110A | |
| Aluiminum Wire | Bob Martin Company | 6061 ALUM | |
| oscilloscope | Agilent | DSO3062A | |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 21008-178 | |
| 15 mL centrifuge tube | VWR | 21008-216 | |
| T75 culture flask | VWR | 82050-862 | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine, 3000 MW, Anionic | Gibco, Life Technologies | D3307 | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine, 70,000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D1819 | |
| Dextran, Texas Red, 3000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D3329 |
References
- Nakamura, H., Funahashi, J. Electroporation Past present and future. Dev Growth Diff. 55, 15-19 (2013).
- Geng, T., Lu, C. Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery. Lab Chip. 13, 3803-3821 (2013).
- Shahini, M., van Wijngaarden, F., Yeow, J. T. W. Fabrication of electro-microfluidic channel for single cell electroporation. Biomedical Microdevices. 15, 759-766 (2013).
- Neumann, E., Toensing, K., Kakorin, S., Budde, P., Frey, J. Mechanism of electroporative dye uptake by mouse B cells. Biophysical Journal. 74, 98-108 (1998).
- Jaroszeski, M. J., et al. Toxicity of anticancer agents mediated by electroporation in vitro. Anti-Cancer Drugs. 11, 201-208 (2000).
- Buntru, M., Gartner, S., Staib, L., Kreuzaler, F., Schlaich, N. Delivery of multiple transgenes to plant cells by an improved version of MultiRound Gateway technology. Transgenic Res. 22, 153-167 (2013).
- Mir, L. M., et al. High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4262-4267 (1999).
- Heller, R., et al. Intradermal delivery of interleukin-12 plasmid DNA by in vivo electroporation. DNA Cell Biol. 20, 381-381 (2001).
- Boukany, P. E., et al. Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells. Nat Nanotechnol. 6, 747-754 (2011).
- Wang, J., et al. Synergistic Effects of Nanosecond Pulsed Electric Fields Combined with Low Concentration of Gemcitabine on Human Oral Squamous Cell Carcinoma. In Vitro PLoS One. 7, (2012).
- Kim, M. J., Kim, T., Cho, Y. H. Cell electroporation chip using multiple electric field zones in a single channel. Appl Phys Lett. 101, (2012).
- Wang, S. N., Lee, L. J. Micro-/nanofluidics based cell electroporation. Biomicrofluidics. 7, (2013).
- Sharei, A., et al. A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery. Proc. Natl Acad Sci USA. 110, 2082-2087 (2013).
- Kim, J. B., et al. Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4. Nature. 461, U649-U693 (2009).
- Ozbas-Turan, S., Aral, C., Kabasakal, L., Keyer-Uysal, M., Akbuga, J. Co-encapsulation of two plasmids in chitosan microspheres as a non-viral gene delivery vehicle. J Pharm Pharm Sci. 6, 27-32 (2003).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, U311-U313 (2007).
- Hur, S. C., Mach, A. J., Di Carlo, D. High-throughput size-based rare cell enrichment using microscale vortices. Biomicrofluidics. 5, (2011).
- Yun, H. Y., Hur, S. C. Sequential multi-molecule delivery using vortex-assisted electroporation. Lab Chip. 13, 2764-2772 (2013).
- Gehl, J. Electroporation theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiol Scand. 177, 437-447 (2003).
- Wang, J., Zhan, Y. H., Ugaz, V. M., Lu, C. Vortex-assisted DNA delivery. Lab Chip. 10, 2057-2061 (2010).
- Jia, F. J., et al. A nonviral minicircle vector for deriving human iPS cells. Nature Methods. 7, U146-U197 (2010).
- Dunbar, C. E. Gene transfer to hematopoietic stem cells Implications for gene therapy of human disease. Annual Review of Medicine. 47, 11-20 (1996).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angew Chem-Int Edit. 37, 551-575 (1998).
- Graziadei, L., Burfeind, P., Barsagi, D. Introduction of Unlabeled Proteins into Living Cells by Electroporation and Isolation of Viable Protein-Loaded Cells Using Dextran Fluorescein Isothiocyanate as a Marker for Protein-Uptake. Anal Biochem. 194, 198-203 (1991).
- Dimitrov, D. S., Sowers, A. E. Membrane Electroporation-Fast Molecular-Exchange by Electroosmosis. Biochimica Et Biophysica Acta. 1022, 381-392 (1990).
- Sukharev, S. I., Klenchin, V. A., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev Yu, A. Electroporation and electrophoretic DNA transfer into cells. The effect of DNA interaction with electropores. Biophysical Journal. 63, 1320-1327 (1992).
- Glogauer, M., McCulloch, C. A. G. Introduction of large molecules into viable fibroblasts by electroporation Optimization of loading and identification of labeled cellular compartments. Experimental Cell Research. 200, 227-234 (1992).
- Verspohl, E. J., KaiserlingBuddemeier, I., Wienecke, A. Introducing specific antibodies into electropermeabilized cells is a valuable tool for eliminating specific cell functions. Cell Biochemistry and Function. 15, 127-134 (1997).
