Microscala Vortex-assistita Elettroporatore per sequenziale molecolare di consegna
Summary
Un vortice microfluidica piattaforma elettroporazione assistito è stato sviluppato per la consegna sequenziale di più molecole in popolazioni di cellule identiche, con un controllo preciso e indipendente il dosaggio. Formato basato fase di purificazione delle cellule bersaglio precedente elettroporazione del sistema aiutato a migliorare l'efficienza di consegna molecolare e la vitalità cellulare trasformati.
Abstract
Elettroporazione ha ricevuto crescente attenzione negli ultimi anni, perché è una tecnica molto potente per introdurre fisicamente non permeanti sonde molecolari esogeni in cellule. Questo lavoro riporta una piattaforma elettroporazione microfluidica in grado di effettuare la consegna molecola multiplo per cellule di mammifero con un controllo preciso e molecolare-dipendente parametro. La capacità del sistema di isolare le cellule con distribuzione di dimensione uniforme permette per meno variazione di efficienza elettroporazione per data intensità di campo elettrico; quindi una maggiore redditività del campione. Inoltre, la sua funzione di visualizzazione di processo consente di osservazione del processo di assorbimento molecolare fluorescente in tempo reale, che permette rapide regolazioni dei parametri consegna molecolari in situ per il miglioramento dell'efficienza. Per mostrare le vaste funzionalità della piattaforma segnalati, macromolecole con diverse dimensioni e cariche elettriche (ad esempio, Destrano con MW di 3.000 e 70.000 Da) sono staticonsegnato alle cellule del cancro al seno metastatico con elevate efficienze di consegna (> 70%) per tutte le molecole testate. La piattaforma sviluppata ha dimostrato il suo potenziale per l'uso nella espansione dei campi di ricerca in cui on-chip tecniche di elettroporazione può essere utile.
Introduction
Negli ultimi anni, l'uso di impulsi elettrici per facilitare l'erogazione citosolico di molecole extracellulari è diventato un dispositivo interessante per manipolare cellule di mammifero. 1 Questo processo, noto anche come elettroporazione, permeabilizes reversibilmente la membrana cellulare, permettendo membrana intrinsecamente molecole impermeabili per accedere di ambiente intracellulare delle cellule. Perché praticamente qualsiasi molecola può essere introdotto nel citoplasma tramite i pori temporanei creati nella membrana di qualsiasi tipo di celle utilizzando elettroporazione, la tecnica è stata segnalata come più riproducibile, universalmente applicabile, e più efficiente rispetto ad altri metodi, tra cui virus-mediata, chimica e gli approcci ottici. 2-3 Questa tecnica è stata utilizzata per introdurre molecole fluorescenti, 4 farmaci 5 e acidi nucleici 6-7, mantenendo le cellule vitali e intatto. Alla luce di questi vantaggi, l'elettroporazione è stato adottato come un lavoro comunetorio tecnica per la trasfezione del DNA, in vivo terapia genica 8 e studi di vaccinazione cella. E ', tuttavia, ancora difficile per i sistemi di elettroporazione convenzionali per ottenere contemporaneamente l'efficienza pratica e la redditività per i campioni con grande eterogeneità in termini di dimensioni, perché la forza del campo elettrico necessario per l'elettroporazione di successo è strettamente correlata con il diametro della cellula. Inoltre, tali sistemi non consentono un controllo preciso delle somme molecolari multipli consegnato a causa di affidamento sulle bulk processo stocastico consegna molecolare. 9 Al fine di risolvere questi problemi, molti gruppi hanno sviluppato piattaforme di elettroporazione microfluidica, offrendo il vantaggio di tensioni poration inferiori, migliore efficienza di trasfezione, una forte riduzione della mortalità delle cellule, e la capacità di fornire più molecole. 10-13 Tali vantaggi sono stati resi possibili grazie alle piccole orme dei sistemi di elettroporazione microscala il cui elettrodo passolunghezze sono sub-millimetri, drammaticamente diminuendo le tensioni necessarie per la consegna di successo. Inoltre, questi sistemi di elettroporazione microscala possono raggiungere una distribuzione uniforme del campo elettrico e rapidamente dissipare il calore generato, producendo una ridotta mortalità cellulare, migliorando l'efficienza di consegna. L'utilizzo di materiali trasparenti per questi microchip ulteriori permette osservazione in situ del processo di elettroporazione per la modifica dei parametri del prompt. 2,12 Tuttavia, il controllo preciso dosaggio e controllo molecular- e cellulare-dipendenti dei parametri, necessari per la ricerca e le applicazioni terapeutiche, 6 emergenti, 14-16 rimangono ancora irrisolti.
Questo lavoro presenta un sistema di elettroporazione microfluidica vortice assistita, in grado di erogare più molecole sequenzialmente in una popolazione preselezionata identica di cellule bersaglio. Celle con distribuzione granulometrica uniforme sono isolati prima di elettroporazione utilizzando riportato in precedenza SImeccanismo ze-selettivi di cattura. 17-18 Avendo una distribuzione uniforme dimensioni, meno variazione di efficienza elettroporazione e una maggiore redditività per data intensità di campo elettrico sono stati raggiunti. 19 Inoltre, agitando continuamente cellule intrappolate utilizzando vortici microscala permesso per la consegna uniforme di molecole attraverso la intero citosol, in accordo con i risultati riportati in precedenza con un'altra piattaforma elettroporazione vortice-assistita. 20 Per dimostrare che questo sistema sarebbe applicabile a una vasta gamma di molecole comunemente utilizzati in applicazioni biologiche, macromolecole con una vasta gamma di pesi molecolari sono state consegnate a cellule del carcinoma mammario metastatico. Inoltre, con l'aiuto di monitoraggio del processo in tempo reale, questo lavoro fornisce ulteriori prove per mettere fine al lungo dibattito in piedi per quanto riguarda il meccanismo di consegna molecolare durante electrporation, essendo prevalentemente elettroforesi-mediata contro la diffusione mediata. 14 </sup> A differenza di altri sistemi di elettroporazione, questa piattaforma offre unicamente i vantaggi combinati di preciso consegna multi-molecola, ad alta efficienza di consegna molecolare, mortalità cellulare minimale, per un'ampia gamma di dimensioni e accuse di molecole consegnato, così come la visualizzazione in tempo reale della elettroporazione processo. Date queste funzionalità, il sistema di elettroporazione sviluppato ha un potenziale pratico come uno strumento versatile per gli studi di riprogrammazione cellulare, applicazioni di consegna della droga 6,14,21-22 10,19 e le applicazioni che richiedono per la comprensione approfondita dei meccanismi di erogazione di elettroporazione molecolari.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con la nuova piattaforma elettroporazione parallelizzati, aumento di 10 volte in velocità e l'efficienza della consegna multi-molecola è stata ottenuta in aggiunta a tutti i meriti che il sistema monocamerale precedentemente sviluppato fornisce. Meriti 18 Precedentemente disponibili includono (i) pre-purificazione della colpire le cellule con distribuzione uniforme di formato per la valorizzazione vitalità, (ii) un controllo preciso e individuale dosaggio molecolare, e (iii) a bassa corrente elettrica …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è supportato dal programma Rowland Junior Fellow. Gli autori desiderano esprimere gratitudine ai ricercatori e al personale presso l'Istituto Rowland ad Harvard: Chris Stokes per il suo aiuto nello sviluppo della, configurazione controllo della pressione custom-built computer-assistita, Diane Schaak, Ph.D. per il suo ingresso per la manipolazione dei campioni biologici, Winfield Hill per sviluppare l'installazione elettrica, Alavaro Sanchez, Ph.D. per concedere l'accesso al citofluorimetro, Scott Bevis, Kenny Spencer e Don Rogers per la lavorazione di componenti idraulici meccanici necessari per l'installazione di pressione. Maestri microfluidica sono stati realizzati presso il Centro per Nanoscale Systems (CNS) presso la Harvard University.
Materials
| MDA-MB-231 cancer cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-26 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Cellgro, Mediatech, Inc. | 10-045-CV | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco, Life Technologies | 16000-044 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Cellgro, Mediatech, Inc. | 21-030 | |
| Trypsin | Gibco, Life Technologies | 25200-056 | |
| Flow Cytometer easyCyte HT | Millipore | 0500-4008 | |
| Oxygen Plasma Cleaner | Technics Micro-RIE | ||
| Dektak 6M surface profiler | Veeco | ||
| KMPR 1050 | Microchem | ||
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning | ||
| Compressed Nitrogen gas | Airgas | NI 300 | |
| High Pressure Regulator | McMaster-Carr | 6162K22 | |
| Downstream regulator | McMaster-Carr | 4000K563 | |
| high-speed 3/2way-8 valve manifold | Festo | ||
| Inline Check Valve | Idex Health and Science | CV3320 | |
| 5/32" OD x 3/32"ID Polyurethan tubes | Pneumadyne | PU-156F-0 | |
| 1/4" OD X 0.17" ID Polyurethan tubes | Pneumadyne | PU-250PB-4 | |
| 1/16" PEEK tubings | Festo | P1533 | |
| 1/32" PEEK tubings | Idex Health and Science | P1569 | |
| PEEK tubing unions | Idex Health and Science | P881 | |
| Pulse Generator | HP | 8110A | |
| Aluiminum Wire | Bob Martin Company | 6061 ALUM | |
| oscilloscope | Agilent | DSO3062A | |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 21008-178 | |
| 15 mL centrifuge tube | VWR | 21008-216 | |
| T75 culture flask | VWR | 82050-862 | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine, 3000 MW, Anionic | Gibco, Life Technologies | D3307 | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine, 70,000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D1819 | |
| Dextran, Texas Red, 3000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D3329 |
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