Microscale Vortex-unterstützte Electroporator für Sequential Molekulare Liefer
Summary
Eine mikrofluidische Vortex Assisted Elektroporation Plattform wurde für die sequentielle Übertragung mehrerer Moleküle in Zellpopulationen identisch mit präzisen und unabhängigen Steuer Dosierung entwickelt. Größe basiert Zielzelle Reinigungsschritt voran Elektroporation des Systems geholfen, um molekulare Lieferung Effizienz und verarbeitet die Lebensfähigkeit der Zellen zu verbessern.
Abstract
Elektroporation wurde zunehmende Aufmerksamkeit in den letzten Jahren erhalten, weil es ein sehr leistungsfähiges Verfahren zum physikalischen Einführen nicht-durchdringenden exogenen molekulare Sonden in Zellen. Diese Arbeit berichtet über eine mikrofluidische Plattform Elektroporation der Lage ist, mehrere Molekül Lieferung an Säugetierzellen mit präzisen und molekularen abhängigen Parametersteuerung. Die Fähigkeit des Systems, um Zellen mit einheitlicher Größenverteilung zu isolieren lässt weniger Variation in Elektroporationseffizienz pro gegebenem elektrischen Feldstärke; damit verbesserte Probenfähigkeit. Darüber hinaus ermöglicht die Beobachtung des Fluoreszenzmolekularaufnahmeprozess in Echtzeit, die prompt Molekular Lieferung Parametereinstellungen zur Effizienzsteigerung ermöglicht in situ seine Prozessvisualisierungsfunktion. Um die riesigen Möglichkeiten der Plattform gemeldet zeigen, Makromoleküle mit verschiedenen Größen und elektrische Ladungen (zB Dextran mit MW von 3.000 und 70.000 Da) warengeliefert metastasierendem Brustkrebs-Zellen mit hoher Fördereffizienzen (> 70%) für alle getesteten Moleküle. Die entwickelte Plattform wurde das Potenzial für den Einsatz in den Ausbau der Forschungsfelder, wo auf dem Chip Elektroporationstechniken von Vorteil sein kann bewiesen.
Introduction
In den letzten Jahren hat die Verwendung von elektrischen Impulsen an das cytosolische Abgabe von extrazellulären Molekülen erleichtern zu einem attraktiven Mittel zum Manipulieren Säugerzellen. 1 Dieses, auch als Elektroporation bekannt ist, reversibel permeabilisiert der Zellmembran, so dass für inhärent Membran undurchlässig Moleküle um Zugang zu erhalten intrazellulären Milieu der Zellen. Da praktisch jedes Molekül in das Cytosol über temporäre erzeugt Poren in der Membran von jeder Art von Zellen unter Verwendung von Elektroporation eingebracht werden, ist die Technik, wie berichtet, wobei reproduzierbarer, universell einsetzbar und effizienter als andere Verfahren, einschließlich Virus-vermittelten chemischen und optische Methoden. 2-3 Diese Technik wurde verwendet, um fluoreszierende Moleküle einzuführen, 4 Medikamente 5 und Nukleinsäuren 6-7, während Zellen lebensfähig und intakt. Angesichts dieser Vorteile hat die Elektroporation als eine gemeinsame Arbeits verabschiedetAtory Technik zur DNA-Transfektion in vivo Gentherapie und Zell 8 Vakzinierungsstudien. Es ist jedoch immer noch schwierig für herkömmliche Systeme Elektroporation, gleichzeitig eine praktische Effizienz und Rentabilität für Proben mit großen Heterogenität in der Größe, da die elektrische Feldstärke für eine erfolgreiche Elektroporation erforderlich eng mit Durchmesser der Zelle korreliert. Hinzu kommt, dass diese Systeme nicht erlauben präzise Steuerung der mehreren molekularen Mengen, die durch die Abhängigkeit von Groß stochastischen Molekularlieferprozess geliefert. 9 Um diese Probleme anzugehen, haben viele Gruppen mikrofluidischen Elektroporation Plattformen entwickelt und bietet den Vorteil der geringeren Körperschaftsteuer Spannungen, bessere Transfektionseffizienz, eine große Reduktion der Zellsterblichkeit, und die Fähigkeit, mehrere Moleküle liefern. 10-13 Diese Vorteile wurden möglich durch die kleinen Fußabdrücke von Mikrosystemen, deren Elektroporation ElektrodenabstandLängen sind Unter Millimeter, dramatisch sinkende Spannungen für erfolgreiche Zustellung erforderlich. Darüber hinaus können diese Mikrosysteme Elektroporation einheitliche elektrische Feldverteilung zu erreichen und schnell erzeugte Wärme abzuführen, was reduzierter Zellmortalität und gleichzeitig die Liefereffizienz. Die Nutzung von transparenten Materialien für diese Mikrochips ermöglicht ferner in situ Beobachtung der Elektroporation Prozesses für eine schnelle Parameteränderungen. 2,12 jedoch präzise Dosierung Steuerung und molekular und zellulären abhängigen Parametersteuerung, für die Schwellen Forschung und therapeutische Anwendungen, 6 erforderlich, 14-16 immer noch ungelöst.
In dieser Arbeit wird eine mikrofluidische Wirbelgestützte Elektroporation System liefern kann mehrere Moleküle sequentiell in einer vorgewählten identische Population von Zielzellen. Zellen, die mit gleichmäßigen Größenverteilung vor der Elektroporation isoliert mit zuvor berichteten size-selektive Fangmechanismus. 17-18 Durch eine gleichmäßige Größenverteilung, weniger Schwankungen bei der Elektroporation Effizienz und verbesserte Rentabilität pro gegebenem elektrischen Feldstärke erreicht. 19. Darüber hinaus kontinuierlich gerührt gefangen Zellen unter Verwendung von Mikrowirbel für gleichmäßige Abgabe von Molekülen über die erlaubte gesamte Cytosol, in Übereinstimmung mit den zuvor berichteten Ergebnisse mit einem anderen wirbel unterstützt Elektroporation Plattform. 20. Um zu zeigen, dass dieses System wäre für eine breite Palette von Molekülen in biologischen Anwendungen häufig genutzt, Makromoleküle mit einer breiten Palette von Molekulargewichten wurden geliefert metastasierendem Brustkrebs-Zellen. Darüber hinaus mit Hilfe von Echtzeit-Prozessüberwachung, bietet diese Arbeit mehr Beweise, um ein Ende während electrporation auf die langjährige Debatte über den Mechanismus der molekularen Lieferung setzen, wobei überwiegend Elektrophorese-vermittelte gegenüber diffusions vermittelt. 14 </sup> Im Gegensatz zu anderen Systemen Elektroporation, bietet diese Plattform eindeutig die kombinierten Vorteile der präzisen Multi-Molekül Lieferung, hohe Molekular Lieferung Effizienz, minimale Zellsterblichkeit, einer breiten Spanne von Größe und Kosten der gelieferten Moleküle, sowie Echtzeit-Visualisierung der Elektroporation Prozess. Angesichts dieser Möglichkeiten hat das System entwickelt Elektroporation praktische Potenzial als vielseitiges Werkzeug für die zelluläre Reprogrammierung Studien 6,14,21-22 Drug-Delivery-Anwendungen und Anwendungen, die 10,19 für ein tiefes Verständnis der molekularen Elektroporation Liefermechanismen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mit der neuen Plattform parallelisiert Elektroporation, 10-fache Verstärkung in Durchsatz und Effizienz von Multi-Molekül Lieferung wurde zusätzlich zu all den Vorzügen, die die zuvor entwickelten Ein-Kammer-System bietet erreicht. Bisher 18 verfügbar Verdienste umfassen (i) Vorreinigung Zielzellen mit einheitlicher Größenverteilung für die Lebensfähigkeit Verbesserung, (ii) präzise und individuelle molekulare Dosierungssteuerung, und (iii) geringe Betriebs elektrischen Strom. Fluoreszierend markier…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird von der Rowland Junior Fellow-Programm unterstützt. Die Autoren möchten Dankbarkeit für die Wissenschaftler und Mitarbeiter des Rowland Institute der Harvard auszudrücken: Chris Stokes für seine Hilfe bei der Entwicklung der kundenspezifischen, computergestützte Druckregelung Setup, Diane Schaak, Ph.D. für ihren Beitrag für die biologische Probenhandhabung, Winfield Hill für die Entwicklung der elektrischen Einrichtung, Alavaro Sanchez, Ph.D. für den Zugang zum Durchflusszytometer, Scott Bevis, Kenny Rogers und Don Spencer für die Bearbeitung von mechanischen Komponenten für die Sanitär-Druck-Setup erforderlich Gewährung. Mikrofluidik-Meister wurden am Zentrum für Nanoscale Systems (ZNS) an der Harvard University hergestellt.
Materials
| MDA-MB-231 cancer cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-26 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Cellgro, Mediatech, Inc. | 10-045-CV | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco, Life Technologies | 16000-044 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Cellgro, Mediatech, Inc. | 21-030 | |
| Trypsin | Gibco, Life Technologies | 25200-056 | |
| Flow Cytometer easyCyte HT | Millipore | 0500-4008 | |
| Oxygen Plasma Cleaner | Technics Micro-RIE | ||
| Dektak 6M surface profiler | Veeco | ||
| KMPR 1050 | Microchem | ||
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning | ||
| Compressed Nitrogen gas | Airgas | NI 300 | |
| High Pressure Regulator | McMaster-Carr | 6162K22 | |
| Downstream regulator | McMaster-Carr | 4000K563 | |
| high-speed 3/2way-8 valve manifold | Festo | ||
| Inline Check Valve | Idex Health and Science | CV3320 | |
| 5/32" OD x 3/32"ID Polyurethan tubes | Pneumadyne | PU-156F-0 | |
| 1/4" OD X 0.17" ID Polyurethan tubes | Pneumadyne | PU-250PB-4 | |
| 1/16" PEEK tubings | Festo | P1533 | |
| 1/32" PEEK tubings | Idex Health and Science | P1569 | |
| PEEK tubing unions | Idex Health and Science | P881 | |
| Pulse Generator | HP | 8110A | |
| Aluiminum Wire | Bob Martin Company | 6061 ALUM | |
| oscilloscope | Agilent | DSO3062A | |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 21008-178 | |
| 15 mL centrifuge tube | VWR | 21008-216 | |
| T75 culture flask | VWR | 82050-862 | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine, 3000 MW, Anionic | Gibco, Life Technologies | D3307 | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine, 70,000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D1819 | |
| Dextran, Texas Red, 3000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D3329 |
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