En microfluidic vortex assistert electroporation plattformen ble utviklet for sekvensiell levering av flere molekyler inn i identiske cellepopulasjoner med presis og uavhengig dosering kontroll. Systemets størrelse basert målcellen rensetrinn før elektroporering styrt for å øke molekylleveringseffektiviteten og behandlet celleviabilitet.
Electroporation har fått økt oppmerksomhet de siste årene, fordi det er en svært kraftig teknikk for fysisk å innføre ikke-permeant eksogene molekylære prober inn i cellene. Dette arbeidet rapporterer en microfluidic electroporation plattform stand til å utføre flere molekyl levering til pattedyrceller med presis og molekylær avhengig parameter kontroll. Systemets evne til å isolere celler med ensartet størrelsesfordeling tillater mindre variasjon i elektroporering effektivitet per gitt elektrisk feltstyrke; dermed forbedret sample levedyktighet. Videre sin prosess visualisering funksjonen gir mulighet for observasjon av fluorescerende molekyl opptak prosessen i sanntid, som tillater rask molekylære levering parameterjusteringer in situ for effektivisering. For å vise de enorme mulighetene i rapporterte plattform, makromolekyler med forskjellige størrelser og elektriske ladninger (f.eks Dextran med MW 3000 og 70.000 Da) varlevert til metastatisk brystkreft celler med høy leverings effektivitet (> 70%) for alle testede molekyler. Den utviklede plattformen har vist dens potensial for bruk ved ekspansjon av forskningsfelt hvor på-chip electroporation teknikker kan være fordelaktig.
De siste årene har bruken av elektriske pulser til rette cytosolic levering av ekstracellulære molekyler blitt et attraktivt midler til å manipulere pattedyrceller. 1 Denne prosessen, også kjent som elektroporering, permeabilizes reversibelt cellemembranen, slik at for iboende membran ugjennomtrengelig molekyler for å få tilgang til cellenes intracellulært miljø. Fordi praktisk talt en hvilken som helst molekyl kan bli introdusert inn i cytosol via midlertidige opprettet porene i membranen av hvilken som helst type av celler ved hjelp av elektroporering, har teknikken blitt rapportert å være mer reproduserbar, universelt anvendelig, og mer effektivt enn andre metoder, inkludert virus-mediert, kjemisk og optiske metoder. 2-3 Denne teknikken har blitt anvendt for å innføre fluorescerende molekyler, 4 5 medikamenter og nukleinsyrer 6-7 samtidig som levedyktige celler og intakt. Gitt disse fordelene, har elektroporering blitt vedtatt som et felles arbeidsmarkedAtory teknikk for DNA-transfeksjon, in vivo genterapi 8 og cellevaksinasjonsstudier. Det er imidlertid fremdeles vanskelig for konvensjonelle electroporation systemer for samtidig å oppnå praktisk effektivitet og levedyktighet for prøver med stor heterogenitet i størrelse fordi den elektriske feltstyrke som kreves for vellykket electroporation tett korrelerer med cellens diameter. Dessuten gjør disse systemene ikke tillater presis kontroll av flere molekylære beløpene blir levert på grunn av avhengighet av bulk stokastisk molekylær leveringsprosessen. 9 For å løse disse problemene, har mange grupper utviklet microfluidic electroporation plattformer, som tilbyr fordelen av lavere poration spenninger, bedre transfeksjon effektivitet, en stor reduksjon i dødelighet celle, og evne til å levere flere molekyler. 10-13 Disse fordelene ble gjort mulig på grunn av de små fotavtrykk av mikro electroporation systemer som elektrode banenlengder er under millimeter, dramatisk redusere spenninger som kreves for vellykket levering. Videre kan disse mikro electroporation systemer oppnå jevn elektrisk feltfordeling og raskt spre generert varme, noe som gir redusert dødelighet cellen og samtidig forbedre leveringseffektiviteten. Utnyttelsen av transparente materialer for disse mikrobrikker videre tillater in situ observasjon av electroporation prosess for rask parameter modifikasjoner. 2,12 imidlertid presis dosering og kontroll molekylær- og celleavhengig parameter styring, som kreves for frem forskning og terapeutiske anvendelser, 6, 14-16 fortsatt forbli uløst.
Dette arbeidet viser et mikrofluid vortex-assistert electroporation system, som kan levere flere molekyler sekvensielt inn i et forhåndsvalgt identisk populasjon av målceller. Celler med enhetlig størrelsesfordeling isoleres før elektroporering ved å bruke tidligere rapportert SIze-selektiv overlapping mekanisme. 17-18 Ved å ha en uniform størrelsesfordeling, mindre variasjon i elektroporering effektivitet og forbedret levedyktigheten per gitt elektrisk feltstyrke ble oppnådd. 19. Videre kontinuerlig omrøring fanget celler ved hjelp av mikro virvlene tillatt for jevn levering av molekyler over hele Hele cytosol, i overensstemmelse med resultatene som tidligere er rapportert ved bruk av en annen virvel-assistert electroporation plattform. 20. For å demonstrere at dette system ville være anvendbar på et bredt utvalg av molekyler som vanligvis benyttes i biologiske anvendelser, makromolekyler med et bredt område av molekylvekter ble levert metastatisk brystkreft celler. I tillegg, ved hjelp av sanntids prosessovervåking, gir dette arbeidet mer bevis for å få en slutt på den langvarige debatten om mekanismen molekylær levering i løpet electrporation, å være overveiende elektroforese-mediert versus diffusjon-mediert. 14 </sup> I motsetning til andre systemer electroporation, denne plattformen gir entydig de kombinerte fordeler ved nøyaktig multi-molekyl levering, høye molekylleveringseffektiviteten, minimal dødelighet celle, et vidt spenn av størrelse og kostnader av levert molekyler, samt sanntids-visualisering av elektroporering prosess. Gitt disse evner, har den utviklet electroporation system praktisk potensial som et allsidig verktøy for cellular omprogrammering studier, 6,14,21-22 stoffet levering applikasjoner 10,19 og applikasjoner som krever for inngående forståelse av electroporation molekylære leveringsmekanismer.
Med den nye parallelized electroporation plattform, 10-ganger forbedring i hastigheten og effektiviteten av multi-molekyl levering ble oppnådd i tillegg til de fordeler som den tidligere utviklet enkeltkammersystemet gir. 18. Tidligere tilgjengelige fordeler omfatter (i) før rensing av målrette celler med ensartet størrelsesfordeling for levedyktighet forbedring, (ii) presis og individuelle molekyldoseringskontroll, og (iii) lav operativ elektrisk strøm. Fluorescensmerkede dekstraner ble valgt som moleky…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet støttes av Rowland Junior Fellow program. Forfatterne ønsker å uttrykke takknemlighet til forskere og ansatte ved Rowland Institute ved Harvard: Chris Stokes for hans hjelp i utviklingen av spesialbygde, dataassistert trykkontroll oppsett, Diane Sjakk, Ph.D. for hennes innspill for biologisk prøvehåndtering, Winfield Hill for å utvikle det elektriske oppsettet, Alavaro Sanchez, Ph.D. for å gi tilgang til strømningscytometeret, Scott Bevis, Kenny Spencer og Don Rogers for maskinering mekaniske VVS komponenter som kreves for trykk oppsett. Microfluidic mestere ble fabrikkert ved Senter for nanoskala Systems (CNS) ved Harvard University.
MDA-MB-231 cancer cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-26 | |
Leibovitz’s L-15 Medium | Cellgro, Mediatech, Inc. | 10-045-CV | |
fetal bovine serum (FBS) | Gibco, Life Technologies | 16000-044 | |
penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Cellgro, Mediatech, Inc. | 21-030 | |
Trypsin | Gibco, Life Technologies | 25200-056 | |
Flow Cytometer easyCyte HT | Millipore | 0500-4008 | |
Oxygen Plasma Cleaner | Technics Micro-RIE | ||
Dektak 6M surface profiler | Veeco | ||
KMPR 1050 | Microchem | ||
SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning | ||
Compressed Nitrogen gas | Airgas | NI 300 | |
High Pressure Regulator | McMaster-Carr | 6162K22 | |
Downstream regulator | McMaster-Carr | 4000K563 | |
high-speed 3/2way-8 valve manifold | Festo | ||
Inline Check Valve | Idex Health and Science | CV3320 | |
5/32" OD x 3/32"ID Polyurethan tubes | Pneumadyne | PU-156F-0 | |
1/4" OD X 0.17" ID Polyurethan tubes | Pneumadyne | PU-250PB-4 | |
1/16" PEEK tubings | Festo | P1533 | |
1/32" PEEK tubings | Idex Health and Science | P1569 | |
PEEK tubing unions | Idex Health and Science | P881 | |
Pulse Generator | HP | 8110A | |
Aluiminum Wire | Bob Martin Company | 6061 ALUM | |
oscilloscope | Agilent | DSO3062A | |
50 mL centrifuge tubes | VWR | 21008-178 | |
15 mL centrifuge tube | VWR | 21008-216 | |
T75 culture flask | VWR | 82050-862 | |
Dextran, Tetramethylrhodamine, 3000 MW, Anionic | Gibco, Life Technologies | D3307 | |
Dextran, Tetramethylrhodamine, 70,000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D1819 | |
Dextran, Texas Red, 3000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D3329 |