Micro Vortex-assisted Electroporator för sekventiell Molekylär Leverans
Summary
En mikroflödes virvel assisterad elektroporering plattform utvecklades för sekventiell leverans av flera molekyler i identiska cellpopulationer med exakt och oberoende doseringskontroll. Systemets storlek baserad målcellen reningssteg före elektroporering hjälp för att öka molekylär leveranseffektivitet och bearbetat cellernas livskraft.
Abstract
Elektroporation har fått ökad uppmärksamhet under de senaste åren, eftersom det är en mycket kraftfull teknik för fysiskt införa icke-genomträngande exogena molekylära sonder in i celler. Arbetet redovisar en mikroflödeselektroplattform som kan utföra flera molekyl leverans till däggdjursceller med exakt och molekylär beroende parameterkontroll. Systemets förmåga att isolera celler med enhetlig storleksfördelning möjliggör mindre variation i elektroporation effektivitet per given elektrisk fältstyrka; därmed förbättrad prov livskraft. Dessutom tillåter sin process visualisering funktion för observation av det fluorescerande molekylära upptagsprocessen i realtid, vilket möjliggör snabb leverans parameterjusteringar molekylära på plats för effektivisering. För att visa de stora funktionerna i redovisade plattformen, makromolekyler med olika storlekar och elektriska laddningar (t.ex. dextran med MW 3000 och 70.000 Da) varlevereras till metastatiska bröstcancerceller med hög leveranseffektivitet (> 70%) för alla testade molekyler. Den utvecklade plattformen har visat sin potential att användas i utbyggnaden av forskningsområden där on-chip elektroporation tekniker kan vara till nytta.
Introduction
Under senare år har användningen av elektriska pulser för att underlätta cytosoliskt leverans av extracellulära molekyler blir ett attraktivt sätt att manipulera däggdjursceller. 1 Denna process, även känd som elektroporering, permeabilizes reversibelt cellmembranet, vilket möjliggör i sig membran ogenomträngliga molekyler för att få tillgång till cellernas intracellulära miljö. Eftersom praktiskt taget alla molekyl kan införas i cytosolen via tillfälliga skapade porer i membranet för alla typer av celler med hjälp av elektroporering har tekniken rapporterats som mer reproducerbar, universellt tillämpligt, och effektivare än andra metoder, inklusive virus-medierad, kemiska och optiska metoder. 2-3 Denna teknik har använts för att införa fluorescerande molekyler, fyra läkemedel 5 och nukleinsyror 6-7 samtidigt som cellerna livskraftig och intakt. Med tanke på dessa fördelar, har elektroporering antagits som en gemensam arbetsmarknadAtory teknik för DNA-transfektion, in vivo-genterapi 8 och vaccinationscellstudier. Det är emellertid fortfarande svårt för konventionella elektroporeringssystem för att samtidigt uppnå praktisk effektivitet och viabilitet för prover med stor heterogenitet i storlek eftersom den elektriska fältstyrkan som krävs för framgångsrik elektroporation korrelerar nära med cellens diameter. Dessutom behöver dessa system inte ger exakt kontroll av de olika molekylära mängder levereras på grund av beroendet av bulk stokastisk molekylär leveransprocessen. 9 För att ta itu med dessa frågor, har många grupper utvecklat mikroflödes elektroporation plattformar, erbjuder fördelen av lägre poreringsspänningar, bättre transfektionseffektivitet, en stor minskning av celldöd, och förmåga att leverera flera molekyler. 10-13 Dessa fördelar möjliggjordes på grund av de små spår av mikroskala elektroporation system vars elektrod tonhöjdlängder är under millimeter, dramatiskt minskar spänningar som krävs för en lyckad leverans. Dessutom kan dessa mikroskala elektroporation system uppnå en jämn elektriskt fält fördelning och snabbt försvinna genererade värme, vilket ger minskad celldödlighet samtidigt förbättra leveranseffektiviteten. Utnyttjandet av transparenta material för dessa mikrochips ytterligare möjliggör in situ observation av elektroprocess för snabba parameterändringar. 2,12 Men exakt dosering kontroll och molekylär- och cellberoende parameterkontroll, som krävs för att framväxande forskning och terapeutiska tillämpningar, 6, 14-16 fortfarande olösta.
Detta arbete presenteras ett mikrofluidvirvelassisterad elektroporation systemet, som kan leverera multipla molekyler sekventiellt i en i förväg vald identisk population av målceller. Celler med jämn storleksfördelning isoleras före elektroporering använder tidigare rapporterade size-selektiva fångstmekanism. 17-18 Genom att ha en jämn storleksfördelning, mindre variation i elektro effektivitet och förbättrad lönsamhet per given elektrisk fältstyrka uppnåddes. 19 Vidare ständigt agitera fångade celler med hjälp av mikroskala virvlar tillåtet för jämn leverans av molekyler över Hela cytosolen, i samförstånd med de resultat som tidigare rapporterats med en annan vortex assisterad elektroporering plattform. 20 För att visa att detta system skulle kunna tillämpas på ett brett spektrum av molekyler som vanligen används i biologiska tillämpningar, makromolekyler med en lång rad molekylvikter levererades till metastatiska bröstcancerceller. Dessutom med hjälp av realtidsprocessövervakning, ger detta arbete mer bevis för att få ett slut på den långvariga debatten om mekanismen för molekylär leverans under electrporation, övervägande elektrofores-medierad kontra diffusion-medierad. 14 </sup> Till skillnad från andra elektroporation system, ger denna plattform unikt de kombinerade fördelarna med exakt multi molekyl leverans, hög molekylleveranseffektivitet, minimal celldödlighet, ett brett spann av storlek och avgifter av levererade molekyler, samt realtid visualisering av elektroporering processen. Med tanke på dessa möjligheter, har utvecklat elektrosystemet praktisk potential som ett mångsidigt verktyg för cellulär omprogrammering studier, 6,14,21-22 drogleveransapplikationer 10,19 och applikationer som kräver för fördjupad förståelse av elektroporering molekylära genomförandemekanismer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Med den nya parallelliseras elektroporering plattform, 10-faldig förbättring i genomströmning och effektivitet i fler molekyl leverans uppnåddes förutom alla de meriter som den tidigare utvecklade enkelkammarsystem ger. 18 Tidigare tillgängliga meriter inkluderar (i) för-rening av målceller med jämn storleksfördelning för lönsamhetsförbättring, (ii) exakta och individuella molekylär doseringskontroll, och (iii) låg operativ elektrisk ström. Fluorescerande dextraner valdes som molekyler av int…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av Rowland Junior Fellow-program. Författarna vill uttrycka tacksamhet till de forskare och personal vid Rowland institutet vid Harvard: Chris Stokes för hans hjälp i utvecklingen av skräddarsydda, datorstödd tryckreglering setup, Diane Schaak, Ph.D. för hennes bidrag till biologisk provhantering, Winfield Hill för att utveckla den elektriska installationen, Alavaro Sanchez, Ph.D. för tillgång till flödescytometern, Scott Bevis, Kenny Spencer och Don Rogers för bearbetning av mekaniska VVS komponenter som krävs för installationstrycket. Mikroflödes mästare tillverkades vid Centrum för nanosystem (CNS) vid Harvard University.
Materials
| MDA-MB-231 cancer cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-26 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Cellgro, Mediatech, Inc. | 10-045-CV | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco, Life Technologies | 16000-044 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Cellgro, Mediatech, Inc. | 21-030 | |
| Trypsin | Gibco, Life Technologies | 25200-056 | |
| Flow Cytometer easyCyte HT | Millipore | 0500-4008 | |
| Oxygen Plasma Cleaner | Technics Micro-RIE | ||
| Dektak 6M surface profiler | Veeco | ||
| KMPR 1050 | Microchem | ||
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning | ||
| Compressed Nitrogen gas | Airgas | NI 300 | |
| High Pressure Regulator | McMaster-Carr | 6162K22 | |
| Downstream regulator | McMaster-Carr | 4000K563 | |
| high-speed 3/2way-8 valve manifold | Festo | ||
| Inline Check Valve | Idex Health and Science | CV3320 | |
| 5/32" OD x 3/32"ID Polyurethan tubes | Pneumadyne | PU-156F-0 | |
| 1/4" OD X 0.17" ID Polyurethan tubes | Pneumadyne | PU-250PB-4 | |
| 1/16" PEEK tubings | Festo | P1533 | |
| 1/32" PEEK tubings | Idex Health and Science | P1569 | |
| PEEK tubing unions | Idex Health and Science | P881 | |
| Pulse Generator | HP | 8110A | |
| Aluiminum Wire | Bob Martin Company | 6061 ALUM | |
| oscilloscope | Agilent | DSO3062A | |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 21008-178 | |
| 15 mL centrifuge tube | VWR | 21008-216 | |
| T75 culture flask | VWR | 82050-862 | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine, 3000 MW, Anionic | Gibco, Life Technologies | D3307 | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine, 70,000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D1819 | |
| Dextran, Texas Red, 3000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D3329 |
References
- Nakamura, H., Funahashi, J. Electroporation Past present and future. Dev Growth Diff. 55, 15-19 (2013).
- Geng, T., Lu, C. Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery. Lab Chip. 13, 3803-3821 (2013).
- Shahini, M., van Wijngaarden, F., Yeow, J. T. W. Fabrication of electro-microfluidic channel for single cell electroporation. Biomedical Microdevices. 15, 759-766 (2013).
- Neumann, E., Toensing, K., Kakorin, S., Budde, P., Frey, J. Mechanism of electroporative dye uptake by mouse B cells. Biophysical Journal. 74, 98-108 (1998).
- Jaroszeski, M. J., et al. Toxicity of anticancer agents mediated by electroporation in vitro. Anti-Cancer Drugs. 11, 201-208 (2000).
- Buntru, M., Gartner, S., Staib, L., Kreuzaler, F., Schlaich, N. Delivery of multiple transgenes to plant cells by an improved version of MultiRound Gateway technology. Transgenic Res. 22, 153-167 (2013).
- Mir, L. M., et al. High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4262-4267 (1999).
- Heller, R., et al. Intradermal delivery of interleukin-12 plasmid DNA by in vivo electroporation. DNA Cell Biol. 20, 381-381 (2001).
- Boukany, P. E., et al. Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells. Nat Nanotechnol. 6, 747-754 (2011).
- Wang, J., et al. Synergistic Effects of Nanosecond Pulsed Electric Fields Combined with Low Concentration of Gemcitabine on Human Oral Squamous Cell Carcinoma. In Vitro PLoS One. 7, (2012).
- Kim, M. J., Kim, T., Cho, Y. H. Cell electroporation chip using multiple electric field zones in a single channel. Appl Phys Lett. 101, (2012).
- Wang, S. N., Lee, L. J. Micro-/nanofluidics based cell electroporation. Biomicrofluidics. 7, (2013).
- Sharei, A., et al. A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery. Proc. Natl Acad Sci USA. 110, 2082-2087 (2013).
- Kim, J. B., et al. Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4. Nature. 461, U649-U693 (2009).
- Ozbas-Turan, S., Aral, C., Kabasakal, L., Keyer-Uysal, M., Akbuga, J. Co-encapsulation of two plasmids in chitosan microspheres as a non-viral gene delivery vehicle. J Pharm Pharm Sci. 6, 27-32 (2003).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, U311-U313 (2007).
- Hur, S. C., Mach, A. J., Di Carlo, D. High-throughput size-based rare cell enrichment using microscale vortices. Biomicrofluidics. 5, (2011).
- Yun, H. Y., Hur, S. C. Sequential multi-molecule delivery using vortex-assisted electroporation. Lab Chip. 13, 2764-2772 (2013).
- Gehl, J. Electroporation theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiol Scand. 177, 437-447 (2003).
- Wang, J., Zhan, Y. H., Ugaz, V. M., Lu, C. Vortex-assisted DNA delivery. Lab Chip. 10, 2057-2061 (2010).
- Jia, F. J., et al. A nonviral minicircle vector for deriving human iPS cells. Nature Methods. 7, U146-U197 (2010).
- Dunbar, C. E. Gene transfer to hematopoietic stem cells Implications for gene therapy of human disease. Annual Review of Medicine. 47, 11-20 (1996).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angew Chem-Int Edit. 37, 551-575 (1998).
- Graziadei, L., Burfeind, P., Barsagi, D. Introduction of Unlabeled Proteins into Living Cells by Electroporation and Isolation of Viable Protein-Loaded Cells Using Dextran Fluorescein Isothiocyanate as a Marker for Protein-Uptake. Anal Biochem. 194, 198-203 (1991).
- Dimitrov, D. S., Sowers, A. E. Membrane Electroporation-Fast Molecular-Exchange by Electroosmosis. Biochimica Et Biophysica Acta. 1022, 381-392 (1990).
- Sukharev, S. I., Klenchin, V. A., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev Yu, A. Electroporation and electrophoretic DNA transfer into cells. The effect of DNA interaction with electropores. Biophysical Journal. 63, 1320-1327 (1992).
- Glogauer, M., McCulloch, C. A. G. Introduction of large molecules into viable fibroblasts by electroporation Optimization of loading and identification of labeled cellular compartments. Experimental Cell Research. 200, 227-234 (1992).
- Verspohl, E. J., KaiserlingBuddemeier, I., Wienecke, A. Introducing specific antibodies into electropermeabilized cells is a valuable tool for eliminating specific cell functions. Cell Biochemistry and Function. 15, 127-134 (1997).
