Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.
منذ 1940s انتقال المجهر الإلكتروني (TEM) وقد تم توفير علماء الأحياء مع الصور فائقة الدقة من المواد البيولوجية. ومع ذلك، وبسبب البروتوكولات شاقة وتستغرق وقتا طويلا التي تتطلب أيضا خبرة في إعداد العينات خالية من القطع الأثرية، لا يعتبر TEM تقنية سهلة الاستخدام. إعداد نموذج التقليدي للTEM تستخدم مثبتات كيميائية للحفاظ على الهياكل الخلوية. الضغط العالي التجميد هو cryofixation العينات البيولوجية تحت الضغوط العالية لإنتاج معدلات التبريد سريعة جدا، مما يحد تشكيل الجليد، والتي تضر بسلامة التركيب الدقيق الخلوية. تجميد الضغط العالي واستبدال تجميد حاليا أساليب اختيار لإنتاج أعلى مستوى من الجودة في التشكل أقسام الراتنج لTEM. هذه الأساليب تقلل من القطع الأثرية التي ترتبط عادة مع المعالجة التقليدية للTEM المقاطع رقيقة. بعد cryofixation يتم استبدال المياه المجمدة في العينة مع السائلالمذيبات العضوية في درجات حرارة منخفضة، وتسمى عملية استبدال التجميد. عادة يتم استبدال تجميد على مدى عدة أيام في مخصص، معدات مكلفة. هناك ابتكار مؤخرا يسمح للعملية أن تكتمل في ثلاث ساعات، بدلا من اليومين المعتادة. وعادة ما يعقب ذلك عدة ايام اخرى لإعداد عينة تشمل التسلل وتضمينها في راتنجات الايبوكسي قبل باجتزاء. هنا نقدم بروتوكول الجمع بين تجميد الضغط العالي واستبدال تجميد سريع تمكن مصنع تثبيت العينة التي يتعين إنجازها في غضون ساعات. يمكن بسهولة بروتوكول تكييفها للعمل مع الأنسجة أو الكائنات الحية الأخرى. الأنسجة النباتية هي التي تثير قلقا خاصا بسبب وجود فراغات الهوائية والحويصلات مملوءة بالماء التي تعيق تجميد الخالية من الجليد من المياه. وبالإضافة إلى ذلك، فإن عملية التثبيت الكيميائية طويلة خاصة في النباتات بسبب جدران الخلايا إعاقة تغلغل المواد الكيميائية إلى أعماق الأنسجة. الأنسجة النباتية هي بالتالي particularly تحديا، ولكن هذا البروتوكول هو موثوق بها وينتج عينات من أعلى مستويات الجودة.
لدينا معرفة التركيب الدقيق خلية تأتي أساسا من المجهر الإلكتروني، والتي يمكن حلها من التفاصيل في حدود بضع نانومتر 1. على الرغم من كونها قوية جدا في قرار TEM لا تعتبر سهلة الاستخدام، وإعداد العينات يتطلب وقتا طويلا وبروتوكولات شاقة، ويتطلب بعض الخبرة من ممارس. تثبيت التقليدي للعينات والجمع بين استخدام الألدهيدات ورباعي أكسيد الأوزميوم قبل مزيد من المعالجة التي تشمل الجفاف، والتضمين في الراتنج ومن ثم باجتزاء لإنتاج المقاطع رقيقة جدا أن يتم بعد ذلك ملطخة المعادن الثقيلة. ومع ذلك، فمن المعروف أن التثبيت الكيميائي يمكن ان تنتج القطع الأثرية بما في ذلك تجميع البروتين وفقدان الدهون 1، والتغيرات في الأغشية التي تؤثر في نهاية المطاف عدة مقصورات الخلوية 2. وتنسب هذه القطع الأثرية إلى حد كبير إلى بطء معدل التثبيت والجفاف في درجة حرارة الغرفة 3 و 4 و 5.
<p class="jove_content"> Cryofixation من ارتفاع ضغط التجمد (HPF) يتجنب معظم القطع الأثرية التي تسببها التثبيت الكيميائي. مبدأ cryofixation هو أنه يقلل من درجة التجمد للمياه بنسبة 20 درجة، يبطئ التنوي ونمو بلورات الثلج ويزيد من لزوجة الماء في عينة بيولوجية بحيث المكونات الخلوية ويجمد أساسا 6 و 7. يقلل HPF و درجة حرارة العينة إلى أن من النيتروجين السائل، تحت ضغط عال جدا (210 ميجا باسكال أو 2،100 بار) في ميلي ثانية. عند القيام به بشكل صحيح HPF يمنع تشكيل بلورات الثلج الكبيرة التي يمكن أن تسبب ضررا كبيرا على التركيب الدقيق الخلية. HPF يمكن استخدامها لإصلاح عينات من سمك 100-200 ميكرون في تركيزات نموذجية من المواد المذابة البيولوجية 7. هناك ملاحظات عديدة على الفيزياء والمبادئ الأساسية HPF، على سبيل المثال 1 و 7 و 8.بعد HPF، يتم تحضين العينات في درجة حرارة منخفضة (-78.5 درجة مئوية إلى -90 و# 176؛ C) في وجود المذيبات التي تحتوي على مثبتات الكيميائية العضوية السائلة مثل رباعي أكسيد الأوزميوم، عموما لبضعة أيام. عند هذه الدرجة المنخفضة، يتم استبدال الماء في عينة من المذيبات العضوية، وعادة الأسيتون أو الميثانول 1، 9. وهكذا، وهذا ما يسمى عملية الاستبدال تجميد (FS). ثم يتم تسخين العينة تدريجيا وخلال هذا الوقت هو ثابت، وعادة مع رباعي أكسيد الأوزميوم وخلات اليورانيل 9. يشابك في درجات حرارة منخفضة لديه ميزة تحديد الجزيئات التي يتم يجمد 1. لذا FS تنتج عينات عالية الجودة مقارنة بتلك التي تحددها التثبيت الكيميائية التقليدية في درجة حرارة الغرفة، ولا سيما أنه يؤدي إلى تحسين الحفاظ التركيبية، والحفاظ على أفضل استضداد وتقليل فقدان المكونات الخلوية غير منضم 10 و 11.
ويتم معظم FS على مدى فترات زمنية طويلة، وعادة ما تصل إلى عدة أيام. هذا هو ترو خاصةالبريد لمحطات عينات 12، 13، 14. بروتوكول الأخيرة التي وضعتها وماكدونالد ويب يقلل بدرجة كبيرة من الوقت لFS من عدة أيام إلى عدة ساعات 15. في هم سريعة الاستبدال تجميد (QFS) الإجراء، يتم FS خروج أكثر من 3 ساعات، بينما في FS السوبر سريعة تتم معالجة عينات (SQFS) في 90 دقيقة. نوعية العينات التي تنتجها هذه الأساليب هي مماثلة لتلك التي حققها بروتوكولات FS التقليدية. لقد اعتمد بروتوكول QFS لالتجهيز النهائي من عينات النبات بعد HPF. وقد ثبت هذا لتوفير الوقت فحسب، بل أيضا المال، كما QFS وSQFS استخدام معدات المختبرات المشتركة بدلا من آلات مكلفة المتاحة تجاريا FS.
الأنسجة النباتية غالبا ما تكون صعبة للغاية للتحضير لTEM. في المتوسط، الخلايا النباتية هي أكبر من أي الخلايا البكتيرية أو الحيوانية. وجود مسعور بشرة شمعية، جدران الخلايا سميكة، وفجوات مملوءة بالماء كبيرة تحتوي على الأحماض العضوية، hydrolases والفينول جompounds التي قد تشغل ما يصل إلى 90٪ من حجم الخلية الكلي 16، ووجود فراغات الهوائية يقلل بشدة التوصيل الحراري للنظام 17. علاوة على ذلك، في حالة النباتات، سمك العينة يتجاوز دائما ما يقرب من 20 ميكرون، والحد الأقصى لاستخدام التثبيت الكيميائي. في هذه السماكات، وانخفاض التوصيل الحراري من الماء يمنع معدل تجميد أكثر من -10،000 ° C / ثانية في وسط العينة. مطلوب هذا المعدل لتجنب تشكيل ضررا سداسية الجليد (بلورات الثلج بكثافة أقل وأكبر من 10 إلى 15 نانومتر) 8. معا، وهذه التحديات الحالية على حد سواء تجميد السليم للعينة وFS اللاحقة. ومع ذلك، cryofixation هو أفضل طريقة لتحديد العينات النباتية. هنا يتم تقديم بروتوكول للHPF-QFS من عينات الأنسجة النباتية. وهو يركز على الأنواع نموذج نبات الأرابيدوبسيس thaliana، ولكن تم أيضا استخدامها مع نيكوتيانا benthamiana. توضح النتائج النموذجية التي HPF-QFS تنتج ساmples من نوعية مماثلة لالتقليدية HPF-FS في جزء من الوقت. مع التعديلات المناسبة، كما يمكن استخدام هذا البروتوكول للعينات البيولوجية سميكة نسبيا الأخرى.
نجاح بروتوكول المقدمة هنا يعتمد بشكل كبير على المستخدم. أولا، يتعين إعداد متقدمة لضمان توفير جميع المواد اللازمة متوفرة وبكميات كافية لإكمال كامل المدى HPF-QFS. ثانيا، يجب على المستخدم العمل بسرعة، والانتقال من خطوة إلى خطوة بطريقة فعالة أن يقلل معالجة عينة، وبالتالي ?…
The authors have nothing to disclose.
تحظى بتقدير كبير من اللطف وكرم الدكتور كينت ماكدونالد من جامعة كاليفورنيا في بيركلي. نشكر لمراجع المجهول اقتراحات مفيدة جدا. ويدعم المختبر بورتش سميث صناديق البدء من جامعة تينيسي.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Wohlwend HPF Compact 02 High Pressure Freezing Machine | Technotrade International, Inc | HPF02 | With integrated oscilloscope to display freezing and pressure curves; PC (not included) is required for display of freezing parameters |
Holder for DN 3 x 0.5 mm aluminum apecimen carriers | Technotrade International, Inc | 290 | |
Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type A | Technotrade International, Inc | 241-200 | |
Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type B | Technotrade International, Inc | 242-200 | |
Storage Dewar 20.5 L, MVE Millennium 2000 XC20 | Chart | ||
Baker's yeast | The older the better, to avoid excessive gas (CO2) production | ||
Tooth picks | |||
Thermocouple data logger EL-USB-TC | OMEGA Engineering Inc. | OM-EL-USB-TC | Replacement battery purchased separately |
Temperature probe | Electron Microscopy Sciences | 34505 | |
Heater block 12/13 mm | |||
Rotary shaker | Fisher Scientific | 11-402-10 | |
Leaf punch – Harris Uni-core 2.00 | Ted-Pella Inc. | 15076 | |
Pink dental wax | Electron Microscopy Sciences | 72660 | |
Cryogenic vials 2 mL | Electron Microscopy Sciences | 61802-02 | |
Methanol | |||
Blow dryer | |||
Dry ice | |||
Liquid nitrogen | |||
Acetone | |||
Forceps | Several pairs |