Tandem-Hochdruck-Schnell Einfrieren und Gefriersubstitution von Pflanzengeweben für die Transmissionselektronenmikroskopie

Summary

Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

Abstract

Seit den 1940er Jahren Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bietet seit Biologen mit ultra-hochauflösende Bilder von biologischen Materialien. Doch weil der mühsame und zeitraubende Protokolle, die auch verlangen, Erfahrung in der Herstellung von artefaktfreie Proben, TEM ist nicht als eine benutzerfreundliche Technik. Traditionelle Probenvorbereitung für TEM verwendeten chemischen Fixiermittel, um zelluläre Strukturen zu bewahren. Hochdruckgefrier ist Kryofixation von biologischen Proben bei hohen Drücken sehr schnell Kühlraten zu erzeugen, wodurch die Eisbildung, die nachteilig für die Integrität der zellulären Ultrastruktur schränkt. Hochdruck Gefrieren und Gefriersubstitution sind derzeit die Methode der Wahl zur Herstellung der höchsten Qualität Morphologie Harzabschnitte für TEM. Diese Methoden minimieren die Artefakte, die normalerweise mit herkömmlichen Verarbeitungs für TEM von Dünnschnitten verbunden. Nach Kryofixation das gefrorene Wasser in der Probe wird mit Flüssigkeit ersetztorganischen Lösungsmittel bei tiefen Temperaturen, ein Prozess, der Gefriersubstitution. Gefriersubstitution erfolgt typischerweise über mehrere Tage in gewidmet, teure Ausrüstung durchgeführt. Eine Innovation kann das Verfahren in drei Stunden abgeschlossen sein, anstelle der üblichen zwei Tage. Dies wird typischerweise durch mehrere Tage der Probenvorbereitung, die Infiltration und die Einbettung in Epoxyharzen vor dem Schneiden enthält, gefolgt. Hier präsentieren wir ein Protokoll, die hohe Druckgefrieren und Schnellgefrier Substitution, die Pflanzenprobe Fixierung innerhalb weniger Stunden erreicht werden können. Das Protokoll kann leicht für die Zusammenarbeit mit anderen Geweben oder Organismen angepasst werden. Pflanzengewebe sind von besonderer Bedeutung, da die Anwesenheit von belüfteten Räumen und mit Wasser gefüllte Vakuolen, die eisfreien Gefrieren von Wasser zu verhindern. Darüber hinaus ist der Prozess der chemischen Fixierung besonders lange in Pflanzen durch Zellwände behindert das Eindringen von Chemikalien, tief in das Gewebe. Pflanzengewebe sind daher insbesonsondere Herausforderung, aber dieses Protokoll ist zuverlässig und produziert Proben von höchster Qualität.

Introduction

Unser Wissen über die Ultrastruktur der Zelle kommt hauptsächlich aus Elektronen-Mikroskopie, die Details im Bereich von wenigen Nanometern ¹ auflösen kann. Obwohl er so mächtig in auflösenden TEM nicht als benutzerfreundlich, da die Probenvorbereitung erfordert zeitaufwändige und mühsame Protokolle und verlangt einige Erfahrung aus dem Praktiker. Traditionelle Fixierung der Proben wurde die Verwendung von Aldehyden und Osmiumtetroxid vor der Weiterverarbeitung, die eine Dehydratation umfaßt, Einbetten in Harz und dann Schneiden an Ultradünnschnitten, die anschließend mit Schwermetallen verschmutzt sind produzieren kombiniert. Es ist jedoch bekannt, dass chemische Fixierung kann Artefakte einschließlich Proteinaggregation und Verlust von Lipiden ^1, und Änderungen an Membranen, die letztlich auf mehrere Zellkompartimente ² herzustellen. Diese Artefakte sind weitgehend auf die langsame Geschwindigkeit der Fixierung und Dehydratisierung bei Raumtemperatur ^{3, 4, 5} zurückgeführt.

<p class="Jove_content"> Kryofixation durch Hochdruckgefrier (HPF) vermeidet die meisten der Artefakte, die durch chemische Fixierung verursacht. Das Prinzip der Kryofixation ist, dass es senkt den Gefrierpunkt von Wasser um 20 Grad, verlangsamt die Keimbildung und das Wachstum von Eiskristallen und erhöht die Viskosität von Wasser in einer biologischen Probe, so dass zelluläre Bestandteile sind im wesentlichen immobilisiert ^{6, 7.} HPF nimmt ein Temperatur Probe zu der flüssigen Stickstoff unter hohem Druck (210 MPa oder 2100 bar) in Millisekunden. Wenn richtig gemacht HPF verhindert die Bildung von großen Eiskristallen, die große Schäden an Ultrastruktur der Zelle führen kann. HPF kann verwendet werden, um Proben von 100-200 um Dicke bei typischen Konzentrationen von gelösten Stoffen biologischen ⁷ fixieren. Es gibt zahlreiche Beiträge über die Physik und Grundsätze HPF, zB ^{1, 7, 8.}

Nach HPF Proben werden bei niedriger Temperatur (-78,5 ° C bis -90 inkubiert und# 176, c) in Gegenwart eines flüssigen organischen Lösungsmittels, das chemische Fixiermittel wie Osmiumtetroxid, in der Regel einige Tage. Bei dieser niedrigen Temperatur wird das Wasser in der Probe durch das organische Lösungsmittel, üblicherweise Aceton oder Methanol ^{1, 9} ersetzt. Somit wird dieser Prozess aufgerufen Gefriersubstitution (FS). Die Probe wird dann nach und nach erwärmt und während dieser Zeit ist festgelegt, in der Regel mit Osmiumtetroxid und Uranylacetat ^9. Vernetzung bei niedrigen Temperaturen hat den Vorteil einer Fixierung Moleküle immobilisiert sind, die ^1. FS erzeugt daher Proben im Vergleich zu denen von herkömmlichen chemischen Fixierung bei Raumtemperatur fixiert höchster Qualität, insbesondere in verbesserten ultra Erhaltung Ergebnisse, bessere Erhaltung der Antigenität und reduziert Verlust von ungebundenen zellulären Komponenten ^{10, 11.}

Die meisten FS erfolgt über lange Zeiträume, typischerweise bis zu mehreren Tagen. Dies ist besonders true für Pflanzen Proben ^{12, 13, 14.} Eine aktuelle Protokoll, das von McDonald und Webb entwickelt reduziert die Zeit für die FS von mehreren Tagen auf wenige Stunden ^15. In ihren Schnellgefriersubstitution (QFS) Verfahren wird FS über 3 Stunden durchgeführt, während in den super schnell FS (sqfs) Proben werden in 90 Minuten bearbeitet. Die Qualität der Proben durch diese Verfahren hergestellt wird, vergleichbar mit denen von herkömmlichen FS Protokolle ergab. Wir haben die QFS-Protokoll für die Weiterverarbeitung von Pflanzenproben nach HPF angenommen. Dies hat sich nicht nur Zeit, sondern auch Geld sparen, da QFS und sqfs verwenden gemeinsame Laborgeräte statt der kostspielige Handel erhältlichen FS-Maschinen.

Pflanzengeweben sind oft sehr schwierig, für die TEM vorzubereiten. Im Durchschnitt sind Pflanzenzellen größer als entweder bakterielle oder tierische Zellen. Die Anwesenheit von hydrophoben, wachsartigen Kutikula, dicke Zellwände, große mit Wasser gefüllte Vakuolen, die organische Säuren, Hydrolasen und Phenol compounds, dass bis zu 90% des gesamten Zellvolumens einnehmen bis ^16, und das Vorhandensein von belüfteten Räumen stark vermindert die Wärmeleitfähigkeit des Systems ^17. Ferner wird in dem Fall von Pflanzen, die Probendicke fast immer 20 um übersteigt, die Grenze für die Nutzung der chemischen Fixierung. Bei diesen Stärken, die geringe Wärmeleitfähigkeit von Wasser verhindert, dass ein Gefrierrate mehr als -10.000 ° C / s in der Mitte der Probe. Diese Rate ist erforderlich, um schädliche Eisbildung hexagonalen (Eiskristalle mit einer geringeren Dichte und größer als 10 bis 15 nm) zu vermeiden, ^8. Zusammen bilden diese aktuellen Herausforderungen sowohl richtige Einfrieren der Probe und anschließende FS. Dennoch ist Kryofixation die beste Methode für die Festsetzung Pflanzenproben. Hier wird ein Protokoll für die HPF-QFS Pflanzengewebeproben dargestellt. Es konzentriert sich auf das Modell Art Arabidopsis thaliana, hat aber auch mit Nicotiana benthamiana verwendet. Die typischen Ergebnisse zeigen, dass HPF-QFS produziert samples vergleichbarer Qualität zu herkömmlichen HPF-FS in einem Bruchteil der Zeit. Mit der richtigen Einstellung, kann dieses Protokoll auch für andere relativ dicken biologischen Proben verwendet werden.

Protocol

HINWEIS: Das Verfahren erfordert QFS äußerster Sorgfalt und Vorsicht durch den Benutzer und stellen wir diese Sicherheitsmaßnahmen hier als Vorsichtshinweise und Hinweise, wo anwendbar. 1.Vorbereitung für HPF Run Vor Beginn der Probenvorbereitung, schalten Sie den Hochdruckgefrier folgenden Anweisungen des Herstellers. HINWEIS: Die in diesem Protokoll verwendet HPF Einheit ist ein Wohlwend Compact 02 Einheit (1A), und es dauert etwa ein bis ein-und-ein-…

Representative Results

Nachfolgend dargestellten Ergebnisse wurden mit Hilfe eines Wohlwend Compact 02 für HPF (Abbildung 1A) erhalten. Ein großer Vorteil dieses Instruments ist die Leichtigkeit der Verwendung der Probenträger und ihre Halterungen. Bei der Verwendung von anderen Instrumenten, empfiehlt McDonald, dass zwei Benutzer sollten die Durchführung der Probenvorbereitung und HPF, eine Vorbereitung der Proben, während der andere tut das Einfrieren und Transfer zum FS 9 Kryoröhrchen. Doch die Wohlwend Pr…

Discussion

Der Erfolg der hier vorgestellten Protokoll hängt stark von dem Benutzer. Zuerst wird advanced Vorbereitung erforderlich, um sicherzustellen, dass alle notwendigen Materialien leicht verfügbar sind und in ausreichender Menge, um eine gesamte HPF-QFS Lauf abzuschließen. Zweitens muss der Benutzer schnell zu arbeiten, sich von Schritt zu Schritt in einer effizienten Weise, die Handhabung der Proben minimiert und somit Änderungen der nativen Zustand des Gewebes zu minimieren. Sobald Proben werden eingefroren und bevor …

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Wohlwend HPF Compact 02 High Pressure Freezing Machine	Technotrade International, Inc	HPF02	With integrated oscilloscope to display freezing and pressure curves; PC (not included) is required for display  of freezing parameters
Holder for DN 3 x 0.5 mm aluminum apecimen carriers	Technotrade International, Inc	290
Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type A	Technotrade International, Inc	241-200
Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type B	Technotrade International, Inc	242-200
Storage Dewar 20.5 L, MVE Millennium 2000 XC20	Chart
Baker's yeast			The older the better, to avoid excessive gas (CO2) production
Tooth picks
Thermocouple data logger EL-USB-TC	OMEGA Engineering Inc.	OM-EL-USB-TC	Replacement battery purchased separately
Temperature probe	Electron Microscopy Sciences	34505
Heater block 12/13 mm
Rotary shaker	Fisher Scientific	11-402-10
Leaf punch – Harris Uni-core 2.00	Ted-Pella Inc.	15076
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences	72660
Cryogenic vials 2 mL	Electron Microscopy Sciences	61802-02
Methanol
Blow dryer
Dry ice
Liquid nitrogen
Acetone
Forceps			Several pairs