Tandem Yüksek basınçlı Donma ve Transmisyon Elektron Mikroskobu için Bitki Doku Hızlı Dondurma Değişiklik
Summary
Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.
Abstract
1940'larda transmisyon elektron mikroskobu (TEM), biyolojik malzemelerin ultra-yüksek çözünürlüklü görüntüler biyologlara vermektedir beri. Ancak, çünkü aynı zamanda artifakttan ücretsiz numune hazırlama deneyimi talep zahmetli ve zaman alıcı protokoller, TEM kullanıcı dostu bir tekniği olarak kabul edilmez. TEM için numune hazırlanması geleneksel hücresel yapıları korumak için kimyasal tespit kullanılır. Yüksek basınçlı dondurma, bu şekilde selüler genel yapının bütünlüğüne zarar verir buz oluşumunu kısıtlayan çok hızlı soğutma oranlarının, elde etmek için yüksek basınç altında, biyolojik numunelerin cryofixation olan. Yüksek basınçlı dondurma ve dondurularak ikame şu TEM için reçine bölümlerde yüksek kalitede morfolojisini üretmek için tercih edilen yöntemlerdir. Bu yöntemler, genellikle ince kesitlerin TEM için geleneksel işlemler ile bağlantılı etkilerini en aza indirmek. Cryofixation sonra numunenin donmuş suyun sıvı ile değiştirilirDüşük sıcaklıklarda bir organik çözücü, bir ikame olarak adlandırılan bir süreç, dondurularak. Freeze ikame tipik adanmış, pahalı ekipman birkaç gün içinde yapılır. Yeni bir yenilik yerine her zamanki iki gün, işlem üç saat içinde tamamlanması sağlar. Bu, tipik olarak süzülmesini ve kesit önce epoksi reçineleri gömme içeren örnek hazırlama birkaç gün daha fazla takip eder. Burada bitki örneğinin tespit saat içinde gerçekleştirilebilir sağlayan yüksek basınçlı donmayı ve hızlı dondurma ikamesi birleştiren bir protokol mevcut. Protokol kolayca, diğer dokular ya da organizmalar ile çalışmak için adapte edilebilir. Bitki dokuları, çünkü su buzsuz dondurma engel gaz alanları ve suyla doldurulmuş vakuollerin varlığında özel bir endişe vardır. Buna ek olarak, kimyasal sabitleme süreci, doku içinde derine kimyasal maddelerin penetrasyonunu engelleyen hücre duvarları dolayı, bitkiler içerisinde, özellikle uzun. Bitki dokuları, bundan dolayı parçacık halinde olan, taahhüde zorlu, bu protokol, güvenilir ve yüksek kalitede örnekleri üretir ama.
Introduction
Hücre ultrastrüktürü bilgilerimiz birkaç nanometre 1 aralığında ayrıntıları çözebilir elektron mikroskobu, ağırlıklı olarak geliyor. Numune hazırlama zaman alıcı ve zahmetli protokolleri gerektirir ve uygulayıcısı bazı uzmanlık gerektirir gibi çözünürlükte TEM kadar güçlü olmasına rağmen, kullanıcı dostu olarak kabul edilmez. Numunelerin Geleneksel tespit reçine içinde yerleştirilmesi ve daha sonra, ağır metaller ile boyanır ultra-ince kesitlerin kesit, dehidratasyon içerir, ilave işlemden önce aldehit ve ozmiyum tetroksit kullanımını birleştirmektedir. Ancak, kimyasal sabitleme sonuçta çeşitli hücresel bölmeleri 2 etkileyecek zarlarında protein toplama ve lipidlerin 1 kaybı ve değişiklikleri içeren eserler üretebilir bilinmektedir. Bu eserler büyük ölçüde oda sıcaklığında 3, 4, 5, fiksasyon ve dehidratasyon yavaş hızı atfedilir.
<p class="Jove_content"> yüksek basınç dondurma (HPF) tarafından cryofixation kimyasal sabitleme kaynaklanan eserler en önler. Cryofixation çalışma prensibi 7. HPF bir azalır, 20 derece, suyun donma noktasını düşüren buz kristallerinin çekirdeklenme ve büyüme yavaşlar ve hücresel bileşen, esasen 6 immobilize edilir, böylece bir biyolojik numunede suyun viskozitesini arttırdığına olduğu milisaniye olarak çok yüksek basınçlı (210 MPa veya 2100 bar) altında sıvı azot edilene numunesinin sıcaklık. Düzgün yapılmazsa HPF hücre ultrastrüktürdeki büyük zarar verebilir büyük buz kristallerinin oluşumunu önler. HPF biyolojik çözünen 7 tipik konsantrasyonları, 100-200 um kalınlığında örnekleri saptamak için kullanılabilir. HPF, örneğin 1, 7, 8 yatan sayısız fizik yorum ve ilkeler vardır.HPF sonra numuneler -90 ve düşük bir sıcaklıkta (-78.5 ° C enkübe edilirGenellikle birkaç gün boyunca osmiyum tetroksit gibi bir organik çözücü içeren sıvı kimyasal tespit, mevcudiyetinde ° C); 176.. Bu düşük sıcaklıkta, numunedeki su, organik bir çözücü, tipik olarak, aseton veya metanol 1, 9 ile değiştirilir. Bu yüzden, bu işlem olarak adlandırılır dondurularak ikamesi (FS) göstermektedir. Numune, daha sonra yavaş yavaş ısıtılır ve bu süre içinde genellikle ozmiyum tetroksit ve uranil asetat 9 ile sabitlenir. Düşük sıcaklıklarda çapraz bağlama molekülleri 1 hareketsiz sabitleme avantajına sahiptir. FS bu yüzden geliştirilmiş bir ince yapı korunmasını sağlar, özellikle oda sıcaklığında, geleneksel kimyasal tespiti ile tespit kıyasla üstün kaliteli, antijenisite daha iyi korunması örneklerini üreten ve bağlanmamış hücre bileşenlerinin 10, 11 kaybının azaltılması.
En FS tipik olarak birkaç güne kadar, çok uzun süreler boyunca gerçekleştirilir. Bu durum, özellikle bir trubitkilerin örnekleri 12, 13, 14 e. McDonald ve Webb tarafından geliştirilen yeni bir protokol ölçüde birkaç saat 15 birkaç gün FS süresini azaltır. Süper hızlı FS (SQFS) numuneler 90 dakika içinde işlenirken onların hızlı dondurma ikamesi (QFS) prosedürde, FS, 3 saat boyunca gerçekleştirilir. Bu yöntemlerle üretilen örneklerin kalitesi geleneksel fs protokolleri ile elde edilen değerler ile karşılaştırılabilir olan. Biz HPF sonra bitki örneklerinin sonraki işlemlerde QFS protokolü kabul etmiştir. QFS ve SQFS yerine pahalı piyasada mevcut FS makineleri ortak laboratuvar ekipman kullanımı gibi bu zaman ama para değil, sadece kazanmak için kanıtlanmıştır.
Bitki dokusu sık sık TEM hazırlanmak için çok zorlu. Ortalama olarak, bitki hücreleri, bakteri ya da hayvan hücreleri ya da daha büyüktür. Hidrofobik balmumsu üstderi, kalın hücre duvarları, organik asitler, hidrolazlar ve fenolik içeren büyük c suyla doldurulmuş vaküollerin varlığıiyodu olduğu gibi toplam hücre hacmi 16% 90 kadar işgal edebilir ve hava ile temas yerlerin bulunması ciddi sistemin 17 ısı iletkenliği azalır. Bundan başka, bitkilerin durumunda, örnek kalınlığı hemen hemen her zaman 20 um, kimyasal sabitleme amaçlı limiti aşar. Bu kalınlıktaki, suyun düşük ısı iletkenliği, numunenin merkezinde bir dondurma oranı en fazla -10.000 ° C / saniye önler. Bu oran zarar altıgen buz oluşumunu (daha düşük bir yoğunluğa sahip buz kristalleri ve daha büyük 10-15 nm) kaçınmak için gerekli olan 8. Birlikte, numune ve sonraki FS hem uygun donma bu mevcut sorunlar. Bununla birlikte, cryofixation bitki örneklerinin tespiti için en iyi yöntemdir. İşte bitki doku örneklerinin HPF-QFS için bir protokol sunulmuştur. Bu modeli türleri Arabidopsis thaliana'nın odaklanır, ama aynı zamanda Nicotina benthamiana'nın ile kullanılmıştır. Tipik sonuç HPF-QFS sa ürettiğini göstermektedirzamanın bir kısmını geleneksel HPF-FS karşılaştırılabilir kalitede örnek olarak şunlar verilebilir. Uygun düzenlemeler ile, bu protokol, aynı zamanda, nispeten kalın, diğer biyolojik örnekler için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan protokolün başarısı kullanıcıya büyük ölçüde bağlıdır. İlk olarak, gelişmiş hazırlık gerekli tüm maddeler kolaylıkla edinilebilir ve bütün bir HPF-QFS çalıştırmak tamamlamak için yeterli miktarda olmasını sağlamak için gereklidir. İkinci olarak, kullanıcı ve böylece doku yerli durumda değişiklikleri en aza indirerek, örnek işlemlerine en aza indiren bir verimli bir şekilde adım-adım için hareket, hızlı bir şekilde çalışmalıdır. Örnekleri dondurulmuş ve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
UC Berkeley Dr Kent McDonald iyilik ve cömertlik büyük takdir. Biz çok yararlı önerileri için anonim bir eleştirmen teşekkür ederim. Burch-Smith laboratuvar Tennessee Üniversitesi'nden start-up fonları tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Wohlwend HPF Compact 02 High Pressure Freezing Machine | Technotrade International, Inc | HPF02 | With integrated oscilloscope to display freezing and pressure curves; PC (not included) is required for display of freezing parameters |
| Holder for DN 3 x 0.5 mm aluminum apecimen carriers | Technotrade International, Inc | 290 | |
| Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type A | Technotrade International, Inc | 241-200 | |
| Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type B | Technotrade International, Inc | 242-200 | |
| Storage Dewar 20.5 L, MVE Millennium 2000 XC20 | Chart | ||
| Baker's yeast | The older the better, to avoid excessive gas (CO2) production | ||
| Tooth picks | |||
| Thermocouple data logger EL-USB-TC | OMEGA Engineering Inc. | OM-EL-USB-TC | Replacement battery purchased separately |
| Temperature probe | Electron Microscopy Sciences | 34505 | |
| Heater block 12/13 mm | |||
| Rotary shaker | Fisher Scientific | 11-402-10 | |
| Leaf punch – Harris Uni-core 2.00 | Ted-Pella Inc. | 15076 | |
| Pink dental wax | Electron Microscopy Sciences | 72660 | |
| Cryogenic vials 2 mL | Electron Microscopy Sciences | 61802-02 | |
| Methanol | |||
| Blow dryer | |||
| Dry ice | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Acetone | |||
| Forceps | Several pairs |
References
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and cell biology. 130, 877-889 (2008).
- Studer, D., Hennecke, H., Muller, M. High-pressure freezing of soybean nodules leads to an improved preservation of ultrastructure. Planta. 188, 155-163 (1992).
- Bowers, B. a. M. M., Crang, R. F. E., Klomparens, K. L. Ch 2. Artifacts in Biological Electron Microscopy. 2, 13-42 (1988).
- Mollenhauer, H. H., Crang, R. F. E., Klomparens, K. L. Ch 3. Artifacts in Biological Electron Microscopy. , 43-64 (1988).
- Kiss, J. Z., Giddings, T. H., Staehelin, L. A., Sack, F. D. Comparison of the ultrastructure of conventionally fixed and high pressure frozen/freeze substituted root tips of Nicotiana and Arabidopsis. Protoplasma. 157, 64-74 (1990).
- Moor, H., Steinbrecht, R. A., Zierold, K. . Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. , 175-191 (1987).
- Vanhecke, D., Graber, W., Studer, D. Close-to-native ultrastructural preservation by high pressure freezing. Methods in cell biology. 88, 151-164 (2008).
- Dahl, R., Staehelin, L. A. High-pressure freezing for the preservation of biological structure theory and practice. Journal of electron microscopy. 13, 165-174 (1989).
- McDonald, K. High-pressure freezing for preservation of high resolution fine structure and antigenicity for immunolabeling. Methods in molecular biology. 117, 77-97 (1999).
- Hippe-Sanwald, S. Impact of freeze substitution on biological electron microscopy. Microscopy research and technique. 24, 400-422 (1993).
- Kiss, J. Z., McDonald, K. Electron microscopy immunocytochemistry following cryofixation and freeze substitution. Methods in cell biology. 37, 311-341 (1993).
- Segui-Simarro, J. M., Austin 2nd, J. R., White, E. A., Staehelin, L. A. Electron tomographic analysis of somatic cell plate formation in meristematic cells of Arabidopsis preserved by high-pressure freezing. The Plant cell. 16, 836-856 (2004).
- Kobayashi, K., Otegui, M. S., Krishnakumar, S., Mindrinos, M., Zambryski, P. INCREASED SIZE EXCLUSION LIMIT encodes a putative DEVH box RNA helicase involved in plasmodesmata function during Arabidopsis embryogenesis. The Plant cell. 19, 1885-1897 (2007).
- Austin, J. R., 2nd, L. A., Staehelin, Three-dimensional architecture of grana and stroma thylakoids of higher plants as determined by electron tomography. Plant physiology. 155, 1601-1611 (2011).
- McDonald, K. L., Webb, R. I. Freeze substitution in 3 hours or less. Journal of microscopy. 243, 227-233 (2011).
- Taiz, L. The Plant Vacuole. The Journal of experimental biology. , 172-1113 (1992).
- Wilson, S. M., Bacic, A. Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes. Nature protocols. 7, 1716-1727 (2012).
- Ding, B., Turgeon, R., Parthasarathy, M. V. Substructure of freeze-substituted plasmodesmata. Protoplasma. 169, 28-41 (1992).
- McDonald, K. L. Rapid Embedding Methods into Epoxy and LR White Resins for Morphological and Immunological Analysis of Cryofixed Biological Specimens. Microscopy and microanalysis. 20, 152-163 (2014).
- McDonald, K. L., Auer, M. High-pressure freezing, cellular tomography, and structural cell biology. BioTechniques. 41, 137, 139-141 (2006).
- Spiegelhalter, C., et al. From dynamic live cell imaging to 3D ultrastructure novel integrated methods for high pressure freezing and correlative light-electron microscopy. PloS one. 5, e9014 (2010).
- McDonald, K. L. A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues. Journal of microscopy. 235, 273-281 (2009).
