Тандем Замораживание высокого давления и резких похолоданий Замена тканей растений для просвечивающей электронной микроскопии

Summary

Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

Abstract

Поскольку электрон передачи 1940s микроскопии (ПЭМ) оказывает биологов с изображениями ультра-высокого разрешения биологических материалов. Тем не менее, из трудоемких и затратных по времени протоколов, которые также требуют опыт в подготовке без артефактов, образцов, ТЕМ не считается методика удобно. Традиционный пробоподготовки для ПЭМ использовали химические фиксаторы, чтобы сохранить клеточные структуры. Замораживание высокого давления является cryofixation биологических образцов при высоких давлениях производить очень быстрые скорости охлаждения, тем самым ограничивая образование льда, который наносит ущерб целостности клеточной ультраструктуры. Замораживание высокого давления и замена замораживания в настоящее время методом выбора для производства самого высокого качества морфологии в секциях смолы для ТЭМ. Эти методы минимизации артефактов, обычно связанные с традиционной обработке для ТЭМ тонких срезов. После cryofixation замерзшей воды в образце жидкости заменяетсяорганический растворитель при низких температурах, этот процесс называется замещение замерзания. Замораживание замена обычно проводят в течение нескольких дней в посвященном, дорогостоящего оборудования. Недавнее нововведение позволяет процесс должен быть завершен в течение трех часов, вместо обычных двух дней. Это, как правило, следует еще несколько дней пробоподготовки, который включает инфильтрацию и встраивания в эпоксидных смол, прежде чем секционирования. Здесь мы приводим протокол, сочетающий замораживание высокого давления и быстрое замещение замораживания, что позволяет образец фиксация завод, чтобы быть достигнуто в течение нескольких часов. Протокол может быть легко адаптирован для работы с другими тканями или организмов. Растительные ткани вызывают особую озабоченность в связи с наличием газированных пространств и заполненных водой вакуолей, которые препятствуют свободной ото льда замерзание воды. Кроме того, процесс химической фиксации особенно долго растений за счет клеточных стенок, препятствующих проникновению химических веществ, чтобы глубоко в ткани. Растительные ткани, следовательно, участнлярно сложным, но этот протокол является надежным и производит образцы высочайшего качества.

Introduction

Наше знание ультраструктуры клеток поступает в основном из электронной микроскопии, которые могут решить детали в диапазоне от нескольких нанометров ^1. Несмотря на то, настолько мощным, в резолюции ТЭМ не считается удобной, как подготовка образца требуется много времени и трудоемкие протоколы, и требует определенного опыта от врача. Традиционный фиксация образцов объединил использование альдегидов и осмия перед дальнейшей обработки, которая включает обезвоживание, вложение в смоле, а затем секционирования производить ультратонкие срезы, которые затем окрашивали тяжелых металлов. Тем не менее, известно, что химической фиксации может производить артефакты в том числе агрегации белка и липидов потери ^1, и изменения в мембранах, что, в конечном счете влияют несколько клеточных компартментах ^2. Эти артефакты в основном связано с медленной скоростью фиксации и дегидратации при комнатной температуре ^{3, 4, 5.}

<p class="Jove_content"> Cryofixation замораживанием высокого давления (ФВЧ) позволяет избежать большинства артефактов, вызванных химической фиксации. Принцип cryofixation в том, что он снижает температуру замерзания воды на 20 градусов, замедляет зародышеобразования и роста кристаллов льда, и увеличивает вязкость воды в биологическом образце, так что клеточные компоненты, по существу, иммобилизованные ^{6, 7.} ФВЧ уменьшается Температура образца для жидкого азота, под очень высоким давлением (210 МПа или 2100 бар) в миллисекундах. Если все сделано правильно ФВЧ предотвращает образование крупных кристаллов льда, которые могут вызвать серьезные повреждения ультраструктуры клеток. ФВЧ может быть использован для фиксации образцов толщиной 100-200 мкм при типичных концентраций растворенных веществ в биологических ^7. Существуют многочисленные отзывы на физике и принципы, лежащие в основе ФВЧ, например, ^{1, 7, 8.}

После HPF, образцы инкубируют при низкой температуре (-78,5 ° С до -90 &# 176; C) в присутствии жидких органических растворителей, содержащих химических фиксаторов как осмия, как правило, в течение нескольких дней. При такой низкой температуре, вода в образце заменяется на органическом растворителе, обычно ацетон или ^{метанол, 1 9.} Таким образом, этот процесс называется замена замораживания (FS). Затем образец постепенно нагревают, и в течение этого времени является фиксированной, как правило, с осмия и уранил-ацетатом ^9. Сшивание при низких температурах обладает тем преимуществом, фиксации молекулы, которые иммобилизованных ^1. FS, следовательно, производит образцы высшего качества по сравнению с теми, фиксированный с помощью обычной химической фиксации при комнатной температуре, в частности, это приводит к улучшенным сохранением ультраструктуры, лучшей сохранности антигенности и уменьшить потерю несвязанных клеточных компонентов ^{10, 11.}

Большинство FS осуществляется в течение длительных периодов времени, как правило, до нескольких дней. Это особенно Truе для растений образцов ^{12, 13, 14.} Недавнее протокол, разработанный Макдональд и Уэбб значительно сокращает время для FS от нескольких дней до нескольких часов ^15. В их быстрого замещения замораживания (QFS) процедуры, FS осуществляется в течение 3 часов, в то время как в супер быстрых FS образцы (SQFS) обрабатываются в течение 90 минут. Качество образцов, полученных с помощью этих методов можно сравнить с теми, которые давала традиционных протоколов FS. Мы приняли протокол QFS для глубокой переработки растительных образцов после ФВЧ. Это оказалось сэкономить не только время, но и деньги, как QFS и SQFS использовать здравый лабораторного оборудования вместо дорогостоящих коммерчески доступных машин ФС.

Растительные ткани, часто очень сложной, чтобы подготовиться к ТЭМ. В среднем, растительные клетки крупнее, чем либо бактериальных или животных клеток. Наличие гидрофобного восковой кутикулы, толстые клеточные стенки, крупных емкостей, заполненных водой вакуолей, содержащих органические кислоты, гидролазы и фенольного Compounds, что может занимать до 90% от общего объема клеточной ^16, и присутствие газированных пространств строго уменьшается теплопроводность системы ^17. Кроме того, в случае растений, толщина образца почти всегда превышает 20 мкм, предел для использования химической фиксации. В этих толщин, низкой теплопроводности воды предотвращает замораживание со скоростью больше, чем -10000 ° C / сек в центре образца. Этот показатель необходим, чтобы избежать повреждения гексагональную образование льда (ледяные кристаллы с более низкой плотностью и больше, чем от 10 до 15 нм) ^8. Вместе, эти нынешние вызовы как надлежащего замораживания образца и последующих FS. Тем не менее, cryofixation является лучшим методом для фиксации образцы растений. Вот это протокол для ФВЧ-QFS образцов ткани растений представлена. Она сосредоточена на модель вида Arabidopsis THALIANA, но также используется с Nicotiana benthamiana. Типичные результаты показывают, что HPF-QFS производит саmples сопоставимого качества традиционных HPF-FS в долю времени. При правильном корректировок, этот протокол также может быть использована для других относительно толстых биологических образцах.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура QFS требует крайней осторожности и осторожности со стороны пользователя, и мы выделить эти меры предосторожности здесь как предупреждения и примечания, где это возможно. 1.Preparation для ФВЧ Run Перед началом подготовки образцов, включите морозильн?…

Representative Results

Результаты, представленные ниже, были получены с использованием Вольвенд Compact 02 для ФВЧ (Рисунок 1A). Одно из главных преимуществ этого инструмента является простота использования образцов носителей и их носителей. При использовании других инструментов, McDonald рекомендует два п?…

Discussion

Успех протокола, представленного здесь в большой степени зависит от пользователя. Во-первых, расширенный подготовка требуется для того, чтобы все необходимые материалы легко доступны и в достаточном количестве, чтобы завершить весь HPF-QFS пробег. Во-вторых, пользователь должен работать …

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Wohlwend HPF Compact 02 High Pressure Freezing Machine	Technotrade International, Inc	HPF02	With integrated oscilloscope to display freezing and pressure curves; PC (not included) is required for display  of freezing parameters
Holder for DN 3 x 0.5 mm aluminum apecimen carriers	Technotrade International, Inc	290
Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type A	Technotrade International, Inc	241-200
Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type B	Technotrade International, Inc	242-200
Storage Dewar 20.5 L, MVE Millennium 2000 XC20	Chart
Baker's yeast			The older the better, to avoid excessive gas (CO2) production
Tooth picks
Thermocouple data logger EL-USB-TC	OMEGA Engineering Inc.	OM-EL-USB-TC	Replacement battery purchased separately
Temperature probe	Electron Microscopy Sciences	34505
Heater block 12/13 mm
Rotary shaker	Fisher Scientific	11-402-10
Leaf punch – Harris Uni-core 2.00	Ted-Pella Inc.	15076
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences	72660
Cryogenic vials 2 mL	Electron Microscopy Sciences	61802-02
Methanol
Blow dryer
Dry ice
Liquid nitrogen
Acetone
Forceps			Several pairs