Tandem Høytrykks Frysing og Quick Freeze Bytte av plantemateriale for transmisjonselektronmikroskopi

Summary

Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

Abstract

Siden 1940-tallet transmisjonselektronmikroskopi (TEM) har levert biologer med ultra-høyoppløselige bilder av biologisk materiale. Likevel, på grunn av arbeidskrevende og tidkrevende protokoller som også krever erfaring i utarbeidelse av artefakt frie prøver, TEM er ikke betraktet som en bruker-vennlig teknikk. Tradisjonelle prøveopparbeidelse for TEM brukt kjemiske fiksativ å bevare cellulære strukturer. Høytrykks frysing er cryofixation av biologiske prøvene under høyt trykk for å produsere svært raske kjøling priser, og dermed begrense isdannelse, som er skadelig for integriteten til mobil ultrastructure. Fryse substitusjon høytrykks frysing og er i dag de metoder av valget for å produsere den høyeste kvalitet morfologi i harpiks seksjoner for TEM. Disse metodene minimalisere gjenstander som normalt forbindes med konvensjonell behandling for TEM av tynne seksjoner. Etter cryofixation det frosne vann i prøven er erstattet med flytendeorganisk løsningsmiddel ved lave temperaturer, en prosess som kalles fryse substitusjon. Freeze substitusjon er vanligvis utført over flere dager i dedikerte, kostbart utstyr. En fersk innovasjon gjør at prosessen skal være ferdig i tre timer, i stedet for de vanlige to dager. Dette er vanligvis etterfulgt av flere dager med prøveopparbeidelse som inkluderer infiltrasjon og innstøping i epoxyresiner før seksjonering. Her presenterer vi en protokoll som kombinerer høytrykks frysing og hurtigfrys substitusjon som gjør at anlegget prøven fiksering skal gjøres i løpet av timer. Protokollen kan lett tilpasses for å arbeide med andre vev eller organismer. Plantevev er av spesiell interesse på grunn av tilstedeværelsen av karbonisert mellomrom og vannfylte vakuoler som hindrer isfritt frysing av vann. I tillegg er prosessen med kjemisk fiksering særlig lenge i planter på grunn av celleveggene som hindrer inntrengning av kjemikaliene til dyp i vev. Plantemateriale er derfor particsig utfordrende, men denne protokollen er pålitelig og produserer prøver av høyeste kvalitet.

Introduction

Vår kunnskap om celle ultrastructure kommer hovedsakelig fra elektronmikroskopi, som kan løse detaljer i størrelsesorden noen få nanometer ^en. Til tross for å være så kraftig i oppløsning TEM ikke anses brukervennlig, som prøveopparbeidelse krever tidkrevende og arbeidskrevende protokoller, og krever litt kompetanse fra utøveren. Tradisjonell festing av prøvene har kombinert bruk av aldehyder og osmiumtetroksyd før ytterligere behandling som omfatter dehydrering, innstøping i harpiksen og deretter seksjonering for å produsere ultra-tynne seksjoner, som deretter farget med tungmetaller. Imidlertid er det kjent at kjemisk fiksering kan produsere gjenstander inkludert protein aggregering og tap av lipider ^1, og endringer i membraner som til slutt berører flere cellulære avdelinger ^to. Disse gjenstander er i stor grad tilskrives den langsomme rate av fiksering og dehydrering ved romtemperatur ^{3, 4, 5.}

<p class="Jove_content"> Cryofixation ved høytrykks frysing (HPF) unngår de fleste av de artefakter som skyldes kjemisk fiksering. Prinsippet for cryofixation er at den senker frysepunktet for vann ved 20 grader, bremser ned kjernedannelse og vekst av iskrystaller og øker viskositeten av vann i en biologisk prøve, slik at cellebestanddeler er i hovedsak immobilisert ^{6, 7.} HPF reduserer en prøvens temperatur til den for flytende nitrogen, under høyt trykk (210 MPa eller 2100 bar) i millisekunder. Når gjort riktig HPF hindrer dannelse av store iskrystaller som kan forårsake store skader på celle ultrastructure. HPF kan brukes til å løse prøver av 100-200 mikrometer tykkelse ved typiske konsentrasjoner av oppløste stoffer biologiske ^7. Det er mange vurderinger på fysikk og prinsipper som ligger til grunn HPF, f.eks ^{1, 7, 8.}

Etter HPF, blir prøvene inkubert ved lav temperatur (-78,5 ° C til -90 &# 176, C) i nærvær av flytende organiske løsningsmiddel inneholdende kjemisk fiksativ som osmiumtetroxyd, vanligvis i noen dager. Ved denne lave temperatur, blir vannet i prøven erstattet av det organiske oppløsningsmiddel, vanligvis aceton eller metanol ^{1, 9.} Dermed er denne prosess kalt fryse substitusjon (FS). Prøven blir deretter gradvis oppvarmet og i løpet av denne tiden er fast, vanligvis med osmiumtetroxyd og uranyl-acetat ^9. Kryssbinding ved lave temperaturer har den fordel at feste molekyler som er immobilisert ^en. FS derfor produserer prøver av overlegen kvalitet i forhold til de som er faste ved konvensjonell kjemisk fiksering ved romtemperatur, i særdeleshet det resulterer i forbedret ultra bevaring, bedre bevaring av antigenisitet og redusert tap av ubundne cellulære komponenter ^{10, 11.}

De fleste FS blir utført over lange tidsperioder, typisk opp til flere dager. Dette er spesielt true for planter prøver ^{12, 13, 14.} En fersk protokoll utviklet av McDonald og Webb sterkt reduserer tiden for FS fra flere dager til noen timer ^15. I deres hurtigfrys substitusjon (QFS) prosedyre, er FS utført over 3 timer, mens i de super raske FS (SQFS) prøver blir behandlet i løpet av 90 minutter. Kvaliteten av prøver fremstilt ved disse metodene er sammenlignbare med de som er gitt av tradisjonelle FS protokoller. Vi har tatt i QFS protokoll for nedstrøms bearbeiding av planteprøver etter HPF. Dette har vist seg å ikke bare spare tid, men også penger, som QFS og SQFS bruke sunn lab utstyr i stedet for de dyre kommersielt tilgjengelige FS maskiner.

Plantemateriale er ofte svært utfordrende å forberede TEM. I gjennomsnitt, planteceller er større enn enten bakterie-eller dyreceller. Nærværet av hydrofobe voksaktig hårstråene, tykke cellevegger, store vannfylte vakuoler som inneholder organiske syrer, hydrolaser og fenoliske compounds som kan oppta inntil 90% av det totale cellevolum ^16, og tilstedeværelsen av karbonisert mellomrom sterkt reduserer varmeledningsevnen av systemet ^17.. Videre, i tilfelle av planter, prøvetykkelse nesten alltid overskrider 20 mikrometer, den grense for bruk av kjemisk fiksering. Ved disse tykkelser, den lave varmeledningsevne av vann hindrer en frysehastighet mer enn -10 000 ° C / sek i sentrum av prøven. Den hastigheten som kreves for å unngå skadelig sekskantede isdannelse (iskrystaller med en lavere tetthet og større enn 10 til 15 nm) ^8. Sammen utgjør disse gi utfordringer til både riktig frysing av prøven og påfølgende FS. Likevel er cryofixation den beste metoden for å fikse planteprøver. Her en protokoll for HPF-QFS av plante vevsprøver er presentert. Den fokuserer på modellen arter Arabidopsis thaliana, men har også blitt brukt med Nicotiana benthamiana. Den typiske resultater viser at HPF-QFS produserer SAmples av tilsvarende kvalitet til tradisjonelle HPF-FS på en brøkdel av tiden. Med riktige justeringer, kan denne protokoll også brukes til andre forholdsvis tykke biologiske prøver.

Protocol

MERK: QFS prosedyren krever ekstrem forsiktighet og varsomhet av brukeren, og vi fremheve disse sikkerhetsreglene her som forholdsregler og merknader der det er aktuelt. 1.Klargjøring for HPF Run Før du begynner prøveopparbeidelse, slå på høytrykks fryser etter produsentens anvisninger. MERK: HPF enhet som brukes i denne protokollen er en Wohlwend Compact 02 enhet (figur 1A), og det tar ca 12:59-og-en-halv time med oppstartsprosedyren før HPF løper …

Representative Results

Resultatene som presenteres nedenfor er innhentet ved hjelp av en Wohlwend Compact 02 for HPF (figur 1A). En stor fordel med dette instrumentet er den enkle bruken av prøven bærere og dets eiere. Ved bruk av andre instrumenter, anbefaler McDonald at to brukere skal utføre prøveopparbeidelse og HPF, en forbereder prøvene mens den andre gjør frysing og overføring til FS cryovials ni. Imidlertid Wohlwend prøve bærere og holderen er lett nok for en enkelt bruker for å manipulere uavheng…

Discussion

Suksessen av protokollen som presenteres her er svært avhengig av brukeren. Først er avansert forberedelse nødvendig for å sikre at alle nødvendige materialer er lett tilgjengelig og i tilstrekkelig mengde for å fullføre en hel HPF-QFS løp. For det andre må brukeren arbeide raskt, beveger seg fra trinn-til-trinn på en effektiv måte som minimerer prøvehåndtering, og dermed minimere endringer i den opprinnelige tilstand av vevet. Når prøvene er frosset, og før de er dehydrert er det viktig at de holdes kal…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Wohlwend HPF Compact 02 High Pressure Freezing Machine	Technotrade International, Inc	HPF02	With integrated oscilloscope to display freezing and pressure curves; PC (not included) is required for display  of freezing parameters
Holder for DN 3 x 0.5 mm aluminum apecimen carriers	Technotrade International, Inc	290
Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type A	Technotrade International, Inc	241-200
Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type B	Technotrade International, Inc	242-200
Storage Dewar 20.5 L, MVE Millennium 2000 XC20	Chart
Baker's yeast			The older the better, to avoid excessive gas (CO2) production
Tooth picks
Thermocouple data logger EL-USB-TC	OMEGA Engineering Inc.	OM-EL-USB-TC	Replacement battery purchased separately
Temperature probe	Electron Microscopy Sciences	34505
Heater block 12/13 mm
Rotary shaker	Fisher Scientific	11-402-10
Leaf punch – Harris Uni-core 2.00	Ted-Pella Inc.	15076
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences	72660
Cryogenic vials 2 mL	Electron Microscopy Sciences	61802-02
Methanol
Blow dryer
Dry ice
Liquid nitrogen
Acetone
Forceps			Several pairs