إصابة الأنسجة الدماغية في دائرة ثنية الجلد الظهري للماوس: A الجلد رفرف نموذج المعنية بالتحقيق في نقص التروية الحاد الثابتة
Summary
نافذة غرفة الفئران الظهرية ثنية الجلد قدمت يتصور منطقة نقص التروية الحاد المستمر لرفرف العضلي الجلدي. حيوي داخلي برنامج التحصين الموسع ومضان المجهري تصاريح للتقييم المباشر والمتكرر من الأوعية الدموية الدقيقة والقياس الكمي للديناميكا الدم. المورفولوجي ونتائج الدورة الدموية يمكن زيادة المترابطة مع التحليلات النسيجية والجزيئية.
Abstract
على الرغم من الخبرة العميقة والتقنيات الجراحية المتقدمة، والمضاعفات الناجمة عن نقص التروية بدءا من انهيار الجرح إلى نخر الأنسجة واسعة لا تزال تحدث، وخاصة في الجراحة الترميمية رفرف. وقد تم تطوير نماذج تجريبية متعددة رفرف لتحليل الأسباب والآليات الكامنة والتحقيق في استراتيجيات العلاج لمنع المضاعفات الدماغية. العامل المحدد لمعظم النماذج هو إمكانية تفتقر إلى تصور بشكل مباشر ومتكرر العمارة الاوعية الدموية الدقيقة وديناميكا الدم. كان الهدف من هذا البروتوكول إلى تقديم نموذج الفأر راسخة الانتماء هذه العناصر تفتقر المذكورة آنفا. أصعب آخرون طوروا نموذجا لرفرف العضلي الجلدي مع نمط نضح العشوائية التي يخضع نقص التروية الحاد والمستمر في النتائج ~ 50٪ نخر بعد 10 يوما إذا أبقى دون علاج. بمساعدة حيوي داخلي المجهري مضان برنامج التحصين الموسع، وهذا النموذج يسمح غرفة التصور المتكرر للمورفولوجيا وديناميكا الدم في مناطق مختلفة من الفائدة مع مرور الوقت. العمليات المرتبطة بها مثل موت الخلايا المبرمج، والتهاب، وتسرب الاوعية الدموية الدقيقة والأوعية الدموية يمكن التحقيق فيها وربطها المقايسات المناعية والجزيئية البروتين. حتى الآن، أثبتت جدوى واستنساخ النموذج في العديد من الدراسات التجريبية التي نشرت التحقيق أثر مسبقا، peri- وpostconditioning من الأنسجة تحدى ischemically.
Introduction
تغطية تتعرض المواد الوتر والعظام وزرع في جراحة تعتمد على استخدام اللوحات. ورفرف هو كتلة من الأنسجة التي يتم نقلها على عنيق الأوعية الدموية التي تضمن التدفق الشرياني والوريدي تدفق. على الرغم من خبرة واسعة وتوفر مجموعة متنوعة من اللوحات على أن يتم تحويلها، والمضاعفات الناجمة عن نقص التروية بدءا من انهيار الجرح إلى إجمالي خسارة الأنسجة لا تزال اجهتها. في حين أن العلاج المحافظ والتئام بالمقصد الثانوية يمكن أن يتوقع بعد نخر الأنسجة طفيفة، نخر رفرف كبير وعادة ما يتطلب مراجعة العمليات الجراحية، بما في ذلك التنضير، تكييف الجرح وإعادة الإعمار الثانوي. هذا يزيد الاعتلال، يطيل الإقامة في المستشفى، وبالتالي يؤدي إلى زيادة تكاليف الرعاية الصحية.
اللوحات مع نمط غير معروف من الأوعية الدموية أو المناطق perfused لعشوائيا في المنطقة البعيدة النائية من تدفق الشرايين معرضة بشكل خاص لأضرار الدماغية. عكا rdingly، وتقييم العديد من الدراسات التجريبية والسريرية تطوير نخر في كل من، اللوحات النمط المحوري (إمدادات الدم محددة) واللوحات نمط عشوائي (إمدادات الدم غير معروف) 1-3. تستند النتائج الرئيسية عادة على تقييم العيانية للحجم المنطقة الميتة. من أجل تقييم أسباب وآليات نخر الأنسجة أكثر في التفاصيل، ركزت العديد من الدراسات على تحليل دوران الأوعية الدقيقة. وقد استخدمت أساليب مختلفة لقياس نضح الأنسجة، بما في ذلك تحليل للتوتر الأوكسجين الأنسجة باستخدام أقطاب البولاروجرافي 4-5، فضلا عن قياس تدفق الدم باستخدام الليزر دوبلر flowmetry 6-7، صبغة نشر 8، والمجهرية 9-10. هذه التقنيات، ومع ذلك، تسمح فقط لقياس المعلمات غير المباشرة للنضح الأنسجة ولا يمكن لأي التحليل الصرفي للعمليات microhemodynamic داخل منطقة الفردية للمصلحة رفرف.
ر "> Sandison هو معروف أن تكون أول شخص يستخدم غرفة شفافة لفترات طويلة في الدراسات المجراة، الذي كان يقوم به في الأرانب 11 في عام 1943 – وبعد ما يقرب من 20 عاما – كان Algire أول من التكيف مع مثل غرفة شفافة قابلة للتطبيق في الفئران بهدف دراسة سلوك يزرع الصغيرة من الخلايا السرطانية (12). ونظرا لحقيقة أن الفئران هي ما يسمى الحيوانات الجلد فضفاضة وبعد بعض التحسينات الفنية على مدى السنوات التالية، كانت لير وزملاء العمل قادرا على التكيف مع مثل على ظهري ثنية الجلد غرفة تطوير غرفة أصغر وأخف وزنا التيتانيوم. مكنت هذه الغرفة تقييم باستخدام المجهر مضان حيوي داخلي، وهي تقنية تسمح التصور المباشر والمتكرر لعدد من السمات المورفولوجية والأوعية الدقيقة والتغيرات على مر الزمن تحت مختلف الظروف الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض، مثل كما ضخه إصابة نقص التروية-13.في التحقيق في بيrfusion من الجلد والعضلات والعظام اللوحات تحت الظروف العادية والمرضية وقعت اتجاهين: أولا، "الحادة" نماذج رفرف التي لا تستخدم غرفة الظهرية ثنية الجلد مثل صيوان الأذن pedicled في الماوس 14، ومقرها أفقيا رفرف الجلد جزيرة في الهامستر 15 ورفرف مركب pedicled في الفئران (16). ثانيا، "المزمن" نموذج رفرف فيها مزيج من رفرف مع تصاريح غرفة الظهرية ثنية الجلد الأوعية الدقيقة المتكررة يحلل مدى عدة أيام مع حيوي داخلي المجهري مضان. وهو يتألف من رفرف العضلي الجلدي perfused لعشوائيا التي تتكامل في غرفة ثنية الجلد من الفأرة 17. اختير لها نسبة العرض إلى الطول الذي وضع من نقص التروية الحاد المستمر يؤدي باستمرار في ~ 50٪ نخر الأنسجة رفرف بعد 10 إلى 14 يوما رفرف الارتفاع. هذا الحد استنساخه من نخر الأنسجة يسمح مزيد من التقييم على حد سواء، واقية (أي تطوير ليهS نخر) والعوامل الضارة (أي تطوير المزيد من نخر) على الفيزيولوجيا المرضية رفرف. خلال السنوات الأخيرة، عدة منشورات التجريبية مما يدل على أثر مسبقا مختلفة، peri- والإجراءات اللاحقة للتكييف، بما في ذلك إدارة المواد الأنسجة الواقية 18-24 وتطبيق محلي من الإجهاد الفسيولوجية مثل الحرارة 25 و 26 صدمة، ظهرت.
التحليلات الكمية للنخر، الاوعية الدموية الدقيقة التشكل والمعلمات الدقيق microcirculatory يمكن زيادة ربطها التحاليل المناعية وفحوصات البروتين. البروتينات والجزيئات المختلفة بما في ذلك عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF)، synthases أكسيد النيتريك (NOS)، العامل النووي كابا B (NF كيلوبايت) وبروتينات الصدمة الحرارية (HSP-32: الهيم أوكسيجيناز-1 (HO-1) وHSP- 70) وقد ثبت أن تلعب دورا في حماية الأنسجة. على أساس هذا النموذج الغرفة رفرف تم وضع تعديلين في أورديr لتحليل اتساع الأوعية الدموية ودوران الأوعية الدقيقة الجلد الكسب غير المشروع خلال 27 الشفاء وعائية التطورات في رفرف pedicled مع نمط محوري الارواء 28. نقدم نموذجا استنساخه وموثوق بها يتضمن رفرف العضلي الجلدي تحدى ischemically في غرفة الماوس ثنية الجلد. هذا النموذج يسمح التصور النوعي والكمي لدوران الأوعية الدقيقة وديناميكا الدم بواسطة برنامج التحصين الموسع حيوي داخلي المجهري مضان.
Protocol
Representative Results
Discussion
من أجل تقليل المضاعفات الدماغية، وبالتالي تحسين النتائج السريرية، مطلوب معرفة أكثر تفصيلا من العمليات الفسيولوجية المرضية في الأنسجة perfused لرفرف خطيرة. تطوير النماذج الحيوانية الجديدة التي تحاكي نقص التروية الحاد المستمر هي بالتالي إلزامية. وفقا لذلك، تمكنا من تطو…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر كاتارينا Haberland لتحرير الصور. التمويل: تلقى الكاتب كبار KKF على منحة من جامعة ميونخ التقنية لانشاء مختبر أبحاث جديد.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| C57Bl/6 mice 6-8w 20-22g | Charles River | ||
| depilation cream | Veet | any depilation cream | |
| titanium chamber | Irola | 160001 | Halteblech M |
| slotted cheese head screw | Screws and More | 842210 | DIN84 M2x10 |
| hexagon full nut | Screws and More | 93422 | DIN934 M2 |
| snap ring | Schaefer-Peters | 472212 | DIN472 J12x1,0 |
| cover glass | Volab | custom-made cover glass 11,8mm in diameter | |
| fixing foam | tesamoll | 05559-100 | tesamoll Standard I-Profile |
| ketamine hydrochloride | Parke Davis | Ketavet® | |
| dihydroxylidinothiazine hydrochloride | Bayer | Rompun® | |
| Buprenorphin | Essex Pharma | Temgesic® | |
| Saline 0,9% | |||
| desinfection alcohol | |||
| Vicryl 5-0 | Ethicon | V 490 H | |
| Ethilon 5-0 | Ethicon | EH 7823 H | |
| 1ml syringes | |||
| surgical skin marker with flexible ruler | Purple surgical | PS3151 | any surgical skin marker and flexible ruler |
| pointed scissors | |||
| Micro-Scissors | |||
| normal scissors | |||
| 2 clamps | |||
| fine anatomic forceps | |||
| micro-forceps | |||
| hex nuter driver | wiha | 1018 | |
| screwdriver | wiha | 685 | |
| snap ring plier | Knipex | 4411J1 | 12-25mm |
| wire cutter | Knipex | 70 02 160 | Wire cutter is used to cut screws short; 160mm |
| trans-illumination light | IKEA | 501.632.02 | LED light Jansjö; any light |
| magnification glasses | |||
| intravital microscope | Zeiss | 490035-0001-000 | Scope.A1.Axiotech |
| LED system | Zeiss | 423052-9501-000 | Colibri.2 |
| LED module 365nm | Zeiss | 423052-9011-000 | |
| LED module 470nm | Zeiss | 423052-9052-000 | |
| LED module 540-580nm | Zeiss | 423052-9121-000 | |
| Filter set 62 62 HE BFP + GFP + HcRed | Zeiss | 489062-9901-000 | range 1: 350-390nm excitation wavelength split 395 / 402-448nm; range 2: 460-488nm, split 495nm / 500-557nm; range 3: 567-602nm, split 610nm / 615-infinite |
| Filter set 20 Rhodamine | Zeiss | 485020-0000-000 | 540-552nm, split 560, emission 575-640nm |
| 2,5x objective NA=0,06 | Zeiss | 421020-9900-000 | A-Plan 2,5x/0.06 |
| 5x objective NA=0,16 | Zeiss | 420330-9901-000 | EC Plan-Neofluar 5x/0.16 M27 |
| 10x objetive NA=0,30 | Zeiss | 420340-9901-000 | EC Plan-Neofluar 10x/0.30 M27 |
| 20x objective NA=0.50 | Zeiss | 420350-9900-000 | EC Plan-Neofluar 20x/0.50 M27 |
| 50x objective NA=0,55 | Zeiss | 422472-9960-000 | LD Epiplan-Neofluar 50x/0.55 DIC 27 |
| ZEN imaging software | Zeiss | ZenPro 2012 | |
| CapImage | Dr. Zeintl | ||
| Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | 45946 | |
| bisBenzimide H 33342 trihydrochloride | Sigma-Aldrich | B2261 | harmful if swallowed; causes severe skin burns and eye damage, may cause repiratory irritat |
| Rhodamine 6G chloride | Invitrogen | R634 | harmful if swallowed; may cause genetic defects; may cause cancer; may damage fertility or the unborn child |
| Pentobarbital | Merial | Narcoren® |
References
- McFarlane, R., De Young, G., Henry, R. The design of a pedicle flap in the rat to study necrosis and its prevention. Plast Reconstr Surg. 35, 177-182 (1965).
- Finseth, F., Cutting, C. An experimental neurovascular island skin flap for the study of the delay phenomenon. Plast Reconstr Surg. 61, 412-420 (1978).
- Petry, J. J., Wortham, K. A. The anatomy of the epigastric flap in the experimental rat. Plast Reconstr Surg. 74, 410-413 (1984).
- Achauer, B. M., Black, K. S., Litke, D. K. Transcutaneous PO2 in flaps: a new method of survival prediction. Plast Reconstr Surg. 65, 45-45 (1980).
- Vollmar, B., Menger, M. D. Assessment of microvascular oxygen supply and tissue oxygenation in hepatic ischemia/reperfusion. Adv. Exp. Med. Biol. 428, 403-408 (1997).
- Menger, M. D., Barker, J. H., Messmer, K. Capillary blood perfusion during postischemic reperfusion in striated muscle. Plast Reconstr Surg. 89, 1104-1114 (1992).
- Uhl, E., Rösken, F., Curri, S. B., Menger, M. D., Messmer, K. Reduction of skin flap necrosis by transdermal application of buflomedil bound to liposomes. Plast Reconstr Surg. 102, 1598-1604 (1998).
- Pang, C. Y., Neligan, P., Nakatsuka, T., Sasaki, G. H. Assessment of the fluorescein dye test for prediction of skin flap viability in pigs. J Surg Res. 41, 173-181 (1986).
- Hjortdal, V. E., Hansen, E. S., Henriksen, T. B., Kjolseth, D., Soballe, K., Djurhuus, J. C. The microcirculation of myocutaneous island flaps in pigs studied with radioactive blood volume tracers and microspheres of different sizes. Plast Reconstr Surg. 89, 116-122 (1992).
- Pang, C. Y., Neligan, P., Nakatsuka, T. Assessment of microsphere technique for measurement of capillary blood flow in random skin flaps in pigs. Plast Reconstr Surg. 74, 513-521 (1984).
- Sandison, J. C. A new method for the microscopic study of living growing tissues by the introduction of a transparent chamber in the rabbit’s ear. The Anatomical Record. 28, 281-287 (1924).
- Algire, G. H. An Adaptation of the Transparent-Chamber Technique to the Mouse. Journal of the National Cancer Institute. 4, 1-11 (1943).
- Lehr, H. A., Leunig, M., Menger, M. D., Nolte, D., Messmer, K. Dorsal skinfold chamber technique for intravital microscopy in nude mice. Am J Pathol. 4, 1055-1062 (1993).
- Barker, J. H., et al. An animal model to study microcirculatory changes associated with vascular delay. Br J Plast Surg. 52, 133-142 (1999).
- Erni, D., Sakai, H., Banic, A., Tschopp, H. M., Intaglietta, M. Quantitative assessment of microhemodynamics in ischemic skin flap tissue by intravital microscopy. Ann Plast Surg. 43, 405-414 (1999).
- Roesken, F., Schäfer, T., Spitzer, W. J., Vollmar, B., Menger, M. D. In vivo analysis of the microcirculation of osteomyocutaneous flaps using fluorescence microscopy. Br J Plast Surg. 52, 644-652 (1999).
- Harder, Y., Amon, M., Erni, D., Menger, M. D. Evolution of ischemic tissue injury in a random pattern flap: a new mouse model using intravital microscopy. J Surg Res. 121, 197-205 (2004).
- Harder, Y., Contaldo, C., Klenk, J., Banic, A., Jakob, S. M., Erni, D. Preconditioning with monophosphoryl lipid A improves survival of critically ischemic tissue. Anesth Analg. 100, 1786-1792 (2005).
- Rezaeian, F., et al. Erythropoieton protects critically perfused flap tissue. Ann Surg. 248, 919-929 (2008).
- Harder, Y., et al. Erythropoietin reduces necrosis in critically ischemic myocutaneous tissue by protecting nutritive perfusion in a dose-dependent manner. Surgery. 145, 10-1016 (2009).
- Rezaeian, F., et al. Erythropoietin-induced upregulation of endothelial nitric oxide synthase but not vascular endothelial growth factor prevents musculocutaneous tissue from ischemic damage. Lab Invest. 90, 40-51 (2010).
- Rezaeian, F., Ong, M. F., Harder, Y., Menger, M. D. N-acetylcysteine attenuates leukocytic inflammation and microvascular perfusion failure in critically ischemic random pattern flaps. Microvasc Res. 82, 28-34 (2011).
- Rezaeian, F., et al. Ghrelin protects musculocutaneous tissue from ischemic necrosis by improving microvascular perfusion. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302, 603-610 (2012).
- Rezaeian, F., et al. Long-term preconditioning with Erythropoietin reduces ischemia-induced skin necrosis. Microcirculation. , (2013).
- Harder, Y., et al. Heat shock preconditioning reduces ischemic tissue necrosis by heat shock protein (HSP)-32-mediated improvement of the microcirculation rather than induction of ischemic tolerance. Ann Surg. 242, 869-878 (2005).
- Tobalem, M., et al. Local shockwave-induced capillary recruitment improves survival of musculocutaneous flaps. J Surg Res. 184, 1196-1204 (2013).
- Lindenblatt, N., Calcagni, M., Contaldo, C., Menger, M. D., Giovanoli, P., Vollmar, B. A new model for studying the revascularization of skin grafts in vivo: the role of angiogenesis. Plast Reconstr Surg. 122, 169-1680 (2008).
- Schweizer, R., et al. Morphology and hemodynamics during vascular regeneration in critically ischemic murine skin studied by intravital microscopy techniques. Eur Surg Res. 47, 222-230 (2011).
- Klyscz, T., Jünger, M., Jung, F., Zeintl, H. Cap image—a new kind of computer-assisted video image analysis system for dynamic capillary microscopy. Biomed. Tech. 42, 168-1675 (1997).
- Gross, J. F., Aroesty, J. Mathematical models of capillary flow: a critical review. Biorheology. 9, 225-264 (1972).
- Menger, M. D., Pelikan, S., Steiner, D. Microvascular ischemiareperfusion injury in striated muscle: significance of ‘reflow paradox. Am J Physiol. 263 (6 part 2), 1901-1906 (1992).
