Ischemische Tissue Injury in de dorsale huidplooien kamer van de Muis: A Skin Flap Model naar Acute Persistent Ischemia Onderzoek
Summary
Het raam van de muizen dorsale huidplooi kamer gepresenteerd visualiseert een zone van acute aanhoudende ischemie van een musculocutane flap. Intravitale epi-fluorescentie microscopie vergunningen voor directe en repetitieve evaluatie van de microvasculatuur en kwantificering van hemodynamiek. Morfologische en hemodynamische resultaten kunnen verder worden gecorreleerd met histologische en moleculaire analyses.
Abstract
Ondanks diepgaande expertise en geavanceerde chirurgische technieken, zijn ischemie geïnduceerde complicaties, variërend van wond afbraak tot uitgebreide weefselnecrose nog steeds voorkomende, met name in de reconstructieve flap chirurgie. Meerdere experimentele flap modellen ontwikkeld onderliggende oorzaken en mechanismen te analyseren en therapeutische strategieën onderzocht om ischemische complicaties te voorkomen. De beperkende factor van de meeste modellen is de ontbrekende mogelijkheid om direct en herhaaldelijk visualiseren microvasculaire architectuur en hemodynamiek. Het doel van het protocol is om een gevestigde muismodel affiliating deze eerder genoemde ontbreken elementen te presenteren. Harder et al. Hebben een model van een musculocutane flap ontwikkeld met een willekeurig patroon dat perfusie acute aanhoudende ischemie en resulteert in ~ 50% necrose ondergaat na 10 dagen als onbehandeld bleef. Met behulp van intravitale epi-fluorescentie microscopie, deze kamer model maakt repetitieve visualisatie vanmorfologie en hemodynamiek in verschillende regio's van belang zijn in de tijd. Bijbehorende processen zoals apoptose, ontsteking, microvasculaire lekkage en angiogenese kunnen onderzocht en gecorreleerd aan immunohistochemische en moleculaire eiwit assays. Tot op heden heeft het model haalbaarheid en reproduceerbaarheid bewezen in verschillende gepubliceerde experimentele studies naar het effect van pre-, peri- en postconditioning van ischemisch uitgedaagd weefsel.
Introduction
Dekking van blootgestelde pees, bot en implantaat materiaal reconstructieve chirurgie berust op het gebruik van flappen. Een flap is een stukje weefsel dat wordt overgebracht op haar vaatsteel dat arteriële instroom en veneuze uitstroom garandeert. Ondanks brede ervaring en de beschikbaarheid van een verscheidenheid van kleppen te dragen, worden ischemie geïnduceerde complicaties variërend van wond afbraak aan totale weefselverlies blijven optreden. Overwegende dat een conservatieve behandeling en genezing door secundaire intentie kan worden verwacht na kleine weefselnecrose, significant flap necrose meestal vereist chirurgische revisie, inclusief debridement, wond conditioning en secundaire reconstructie. Dit verhoogt de morbiditeit, verlengt verblijf in het ziekenhuis en dus leidt tot toegenomen kosten voor gezondheidszorg.
Kleppen met een ongedefinieerde patroon van bloedvaten of willekeurig geperfundeerd gebieden in de distale zone verst van de arteriële instroom zijn bijzonder gevoelig voor ischemische schade. Acco rdingly, hebben talrijke experimentele en klinische studies voor de ontwikkeling van necrose in beide geëvalueerd, axiale patroon flappen (gedefinieerd bloedtoevoer) en willekeurig patroon flappen (undefined bloedtoevoer) 1-3. De belangrijkste resultaten zijn gewoonlijk gebaseerd op macroscopische beoordeling van de omvang van het necrotische gebied. Om de oorzaken en mechanismen van weefselnecrose beoordelen meer in detail verscheidene studies gericht op de analyse van de microcirculatie. Verschillende technieken zijn gebruikt om weefsel perfusie meten, inclusief de analyse van weefsel zuurstofspanning middels polarografische elektroden 4-5, en het meten van de bloedstroom met laser Doppler flowmetry 6-7, kleurstofdiffusie 8 en microsferen 9-10. Deze technieken echter alleen mogelijk voor het meten indirecte parameters van weefselperfusie en geen morfologische analyse van de microhemodynamic processen binnen een bepaald gedeelte van belang van een klep niet mogelijk.
t "> Sandison bekend de eerste die een transparante kamer heeft gedurende langere in vivo studies, waaruit hij bij konijnen 11 zijn in 1943 -. ongeveer 20 jaar later – Algire als eerste dergelijke transparante kamer aangepast toepasbaar zijn in muizen om het gedrag van micro-implantaten van tumorcellen 12 bestuderen. Vanwege het feit dat muizen zogenaamde losse huid dieren na enige technische verfijningen in de volgende jaren Lehr en medewerkers konden zich dergelijke een dorsale huidplooi kamer ontwikkelt een kleinere en lichtere titanium kamer. Deze kamer staat beoordelingsproces met intravitale fluorescentiemicroscopie, een techniek die directe en repetitieve visualisatie van een aantal parameters en functies microcirculatie en de veranderingen in de tijd in verschillende fysiologische en pathofysiologische omstandigheden toelaat, zoals ischemie-reperfusieschade 13.In het onderzoek van perfusion van huid, spieren en botten flappen onder normale en pathologische omstandigheden twee trends voorgedaan: Ten eerste, de "acute" flap modellen die niet de dorsale huidplooi kamer hoeft te gebruiken, zoals de gesteelde oor flap in de muis 14, de zijdelings gebaseerd eiland huidflap in de hamster 15 en de pedicled samengestelde klep in de rat 16. Tweede, de "chronische" flap model waarbij de combinatie van een flap met een dorsale huidplooi kamer toelaat repetitieve microcirculatie analyses over meerdere dagen met intravitale fluorescentiemicroscopie. Het bestaat uit een willekeurig geperfundeerde musculocutane klep die is geïntegreerd in de huidplooi kamer van de muis 17. De breedte-lengte verhouding gekozen dat een situatie van acute aanhoudende ischemie steeds resulteert in ~ 50% flap weefselnecrose 10 tot 14 dagen na flap hoogte. Dit reproduceerbare omvang van weefselnecrose maakt verdere evaluatie van beide, beschermend (dat wil zeggen, de ontwikkeling van de less necrose) en schadelijke factoren (dat wil zeggen, de ontwikkeling van meer necrose) op de flap pathofysiologie. Gedurende de laatste jaren hebben verschillende experimentele studies waarin het effect van verschillende pre-, peri- en post-conditioning procedures, met inbegrip van het beheer van weefsel-beschermende stoffen 18-24 en de lokale toepassing van fysiologische stressoren zoals warmte 25 en schokgolven 26, naar voren zijn gekomen.
De kwantitatieve analyse van necrose, microvasculaire morfologie en microcirculatie parameters kunnen verder worden gecorreleerd aan immunohistochemische analyses en eiwit assays. Verschillende eiwitten en moleculen omvattende vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), stikstofoxide synthase (NOS), nucleaire factor kappa B (NF-kB) en heat shock eiwitten (HSP-32: heem oxygenase-1 (HO-1) en HSP- 70) bleken een rol in weefselbescherming spelen. Op basis van deze kamer flap model, zijn twee wijzigingen zijn in Orde ontwikkeldr om neovascularisatie en de microcirculatie te analyseren tijdens huidtransplantatie genezing 27 en angiogene ontwikkelingen in een gesteelde flap met axiale patroon perfusie 28. We presenteren een reproduceerbare en betrouwbare model dat een ischemisch uitgedaagd musculocutane flap in de muis huidplooi kamer bevinden. Dit model maakt visualisatie en kwantificatie van de microcirculatie en hemodynamiek door intravitale epi-fluorescentie microscopie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Om ischemische complicaties te verlagen en zo het verbeteren van de klinische uitkomst, is meer gedetailleerde kennis van pathofysiologische processen in kritisch geperfuseerde flap weefsel nodig. De ontwikkeling van nieuwe diermodellen dat acute persisterende ischemie na te bootsen is daarom verplicht. Daarom konden we een gemakkelijk reproduceerbaar en betrouwbaar model waardoor herhaalde morfologische, functionele en dynamische real-time evaluatie van de verschillende parameters van spier en huid vasculatuur die kunn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Katharina Haberland voor beeldbewerking. Financiering: De senior auteur ontving een KKF Grant van de Technische Universität München voor het opzetten van een nieuw onderzoekslaboratorium.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| C57Bl/6 mice 6-8w 20-22g | Charles River | ||
| depilation cream | Veet | any depilation cream | |
| titanium chamber | Irola | 160001 | Halteblech M |
| slotted cheese head screw | Screws and More | 842210 | DIN84 M2x10 |
| hexagon full nut | Screws and More | 93422 | DIN934 M2 |
| snap ring | Schaefer-Peters | 472212 | DIN472 J12x1,0 |
| cover glass | Volab | custom-made cover glass 11,8mm in diameter | |
| fixing foam | tesamoll | 05559-100 | tesamoll Standard I-Profile |
| ketamine hydrochloride | Parke Davis | Ketavet® | |
| dihydroxylidinothiazine hydrochloride | Bayer | Rompun® | |
| Buprenorphin | Essex Pharma | Temgesic® | |
| Saline 0,9% | |||
| desinfection alcohol | |||
| Vicryl 5-0 | Ethicon | V 490 H | |
| Ethilon 5-0 | Ethicon | EH 7823 H | |
| 1ml syringes | |||
| surgical skin marker with flexible ruler | Purple surgical | PS3151 | any surgical skin marker and flexible ruler |
| pointed scissors | |||
| Micro-Scissors | |||
| normal scissors | |||
| 2 clamps | |||
| fine anatomic forceps | |||
| micro-forceps | |||
| hex nuter driver | wiha | 1018 | |
| screwdriver | wiha | 685 | |
| snap ring plier | Knipex | 4411J1 | 12-25mm |
| wire cutter | Knipex | 70 02 160 | Wire cutter is used to cut screws short; 160mm |
| trans-illumination light | IKEA | 501.632.02 | LED light Jansjö; any light |
| magnification glasses | |||
| intravital microscope | Zeiss | 490035-0001-000 | Scope.A1.Axiotech |
| LED system | Zeiss | 423052-9501-000 | Colibri.2 |
| LED module 365nm | Zeiss | 423052-9011-000 | |
| LED module 470nm | Zeiss | 423052-9052-000 | |
| LED module 540-580nm | Zeiss | 423052-9121-000 | |
| Filter set 62 62 HE BFP + GFP + HcRed | Zeiss | 489062-9901-000 | range 1: 350-390nm excitation wavelength split 395 / 402-448nm; range 2: 460-488nm, split 495nm / 500-557nm; range 3: 567-602nm, split 610nm / 615-infinite |
| Filter set 20 Rhodamine | Zeiss | 485020-0000-000 | 540-552nm, split 560, emission 575-640nm |
| 2,5x objective NA=0,06 | Zeiss | 421020-9900-000 | A-Plan 2,5x/0.06 |
| 5x objective NA=0,16 | Zeiss | 420330-9901-000 | EC Plan-Neofluar 5x/0.16 M27 |
| 10x objetive NA=0,30 | Zeiss | 420340-9901-000 | EC Plan-Neofluar 10x/0.30 M27 |
| 20x objective NA=0.50 | Zeiss | 420350-9900-000 | EC Plan-Neofluar 20x/0.50 M27 |
| 50x objective NA=0,55 | Zeiss | 422472-9960-000 | LD Epiplan-Neofluar 50x/0.55 DIC 27 |
| ZEN imaging software | Zeiss | ZenPro 2012 | |
| CapImage | Dr. Zeintl | ||
| Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | 45946 | |
| bisBenzimide H 33342 trihydrochloride | Sigma-Aldrich | B2261 | harmful if swallowed; causes severe skin burns and eye damage, may cause repiratory irritat |
| Rhodamine 6G chloride | Invitrogen | R634 | harmful if swallowed; may cause genetic defects; may cause cancer; may damage fertility or the unborn child |
| Pentobarbital | Merial | Narcoren® |
References
- McFarlane, R., De Young, G., Henry, R. The design of a pedicle flap in the rat to study necrosis and its prevention. Plast Reconstr Surg. 35, 177-182 (1965).
- Finseth, F., Cutting, C. An experimental neurovascular island skin flap for the study of the delay phenomenon. Plast Reconstr Surg. 61, 412-420 (1978).
- Petry, J. J., Wortham, K. A. The anatomy of the epigastric flap in the experimental rat. Plast Reconstr Surg. 74, 410-413 (1984).
- Achauer, B. M., Black, K. S., Litke, D. K. Transcutaneous PO2 in flaps: a new method of survival prediction. Plast Reconstr Surg. 65, 45-45 (1980).
- Vollmar, B., Menger, M. D. Assessment of microvascular oxygen supply and tissue oxygenation in hepatic ischemia/reperfusion. Adv. Exp. Med. Biol. 428, 403-408 (1997).
- Menger, M. D., Barker, J. H., Messmer, K. Capillary blood perfusion during postischemic reperfusion in striated muscle. Plast Reconstr Surg. 89, 1104-1114 (1992).
- Uhl, E., Rösken, F., Curri, S. B., Menger, M. D., Messmer, K. Reduction of skin flap necrosis by transdermal application of buflomedil bound to liposomes. Plast Reconstr Surg. 102, 1598-1604 (1998).
- Pang, C. Y., Neligan, P., Nakatsuka, T., Sasaki, G. H. Assessment of the fluorescein dye test for prediction of skin flap viability in pigs. J Surg Res. 41, 173-181 (1986).
- Hjortdal, V. E., Hansen, E. S., Henriksen, T. B., Kjolseth, D., Soballe, K., Djurhuus, J. C. The microcirculation of myocutaneous island flaps in pigs studied with radioactive blood volume tracers and microspheres of different sizes. Plast Reconstr Surg. 89, 116-122 (1992).
- Pang, C. Y., Neligan, P., Nakatsuka, T. Assessment of microsphere technique for measurement of capillary blood flow in random skin flaps in pigs. Plast Reconstr Surg. 74, 513-521 (1984).
- Sandison, J. C. A new method for the microscopic study of living growing tissues by the introduction of a transparent chamber in the rabbit’s ear. The Anatomical Record. 28, 281-287 (1924).
- Algire, G. H. An Adaptation of the Transparent-Chamber Technique to the Mouse. Journal of the National Cancer Institute. 4, 1-11 (1943).
- Lehr, H. A., Leunig, M., Menger, M. D., Nolte, D., Messmer, K. Dorsal skinfold chamber technique for intravital microscopy in nude mice. Am J Pathol. 4, 1055-1062 (1993).
- Barker, J. H., et al. An animal model to study microcirculatory changes associated with vascular delay. Br J Plast Surg. 52, 133-142 (1999).
- Erni, D., Sakai, H., Banic, A., Tschopp, H. M., Intaglietta, M. Quantitative assessment of microhemodynamics in ischemic skin flap tissue by intravital microscopy. Ann Plast Surg. 43, 405-414 (1999).
- Roesken, F., Schäfer, T., Spitzer, W. J., Vollmar, B., Menger, M. D. In vivo analysis of the microcirculation of osteomyocutaneous flaps using fluorescence microscopy. Br J Plast Surg. 52, 644-652 (1999).
- Harder, Y., Amon, M., Erni, D., Menger, M. D. Evolution of ischemic tissue injury in a random pattern flap: a new mouse model using intravital microscopy. J Surg Res. 121, 197-205 (2004).
- Harder, Y., Contaldo, C., Klenk, J., Banic, A., Jakob, S. M., Erni, D. Preconditioning with monophosphoryl lipid A improves survival of critically ischemic tissue. Anesth Analg. 100, 1786-1792 (2005).
- Rezaeian, F., et al. Erythropoieton protects critically perfused flap tissue. Ann Surg. 248, 919-929 (2008).
- Harder, Y., et al. Erythropoietin reduces necrosis in critically ischemic myocutaneous tissue by protecting nutritive perfusion in a dose-dependent manner. Surgery. 145, 10-1016 (2009).
- Rezaeian, F., et al. Erythropoietin-induced upregulation of endothelial nitric oxide synthase but not vascular endothelial growth factor prevents musculocutaneous tissue from ischemic damage. Lab Invest. 90, 40-51 (2010).
- Rezaeian, F., Ong, M. F., Harder, Y., Menger, M. D. N-acetylcysteine attenuates leukocytic inflammation and microvascular perfusion failure in critically ischemic random pattern flaps. Microvasc Res. 82, 28-34 (2011).
- Rezaeian, F., et al. Ghrelin protects musculocutaneous tissue from ischemic necrosis by improving microvascular perfusion. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302, 603-610 (2012).
- Rezaeian, F., et al. Long-term preconditioning with Erythropoietin reduces ischemia-induced skin necrosis. Microcirculation. , (2013).
- Harder, Y., et al. Heat shock preconditioning reduces ischemic tissue necrosis by heat shock protein (HSP)-32-mediated improvement of the microcirculation rather than induction of ischemic tolerance. Ann Surg. 242, 869-878 (2005).
- Tobalem, M., et al. Local shockwave-induced capillary recruitment improves survival of musculocutaneous flaps. J Surg Res. 184, 1196-1204 (2013).
- Lindenblatt, N., Calcagni, M., Contaldo, C., Menger, M. D., Giovanoli, P., Vollmar, B. A new model for studying the revascularization of skin grafts in vivo: the role of angiogenesis. Plast Reconstr Surg. 122, 169-1680 (2008).
- Schweizer, R., et al. Morphology and hemodynamics during vascular regeneration in critically ischemic murine skin studied by intravital microscopy techniques. Eur Surg Res. 47, 222-230 (2011).
- Klyscz, T., Jünger, M., Jung, F., Zeintl, H. Cap image—a new kind of computer-assisted video image analysis system for dynamic capillary microscopy. Biomed. Tech. 42, 168-1675 (1997).
- Gross, J. F., Aroesty, J. Mathematical models of capillary flow: a critical review. Biorheology. 9, 225-264 (1972).
- Menger, M. D., Pelikan, S., Steiner, D. Microvascular ischemiareperfusion injury in striated muscle: significance of ‘reflow paradox. Am J Physiol. 263 (6 part 2), 1901-1906 (1992).
