Ischemica lesioni dei tessuti nel Skinfold Camera del mouse Dorsale: un modello lembo cutaneo per Indagare Ischemia acuta persistente
Summary
La finestra della camera di murino plica dorsale presentato visualizza una zona di ischemia acuta persistente di un lembo muscolocutaneo. Intravitale epi-fluorescenza permette di microscopia per la valutazione diretta e ripetitiva del microcircolo e la quantificazione di emodinamica. Morfologiche e risultati emodinamici possono ulteriormente essere correlati con le analisi istologiche e molecolari.
Abstract
Nonostante la profonda esperienza e le tecniche chirurgiche avanzate, complicazioni ischemia indotta che vanno dalla rottura della ferita alla vasta necrosi dei tessuti sono ancora in corso, in particolare in chirurgia ricostruttiva lembo. Più modelli con patta sperimentali sono stati sviluppati per analizzare le cause ei meccanismi alla base e di indagare le strategie di trattamento per prevenire le complicanze ischemiche. Il fattore limitante della maggior parte dei modelli è la possibilità privo di visualizzare direttamente e ripetutamente architettura microvascolare e l'emodinamica. L'obiettivo del protocollo è stato quello di presentare un modello di topo consolidata affiliazione questi elementi mancanti prima menzionati. Harder et al. Hanno sviluppato un modello di un lembo muscolocutaneo con un pattern di perfusione casuale che subisce ischemia persistente acuta e provoca ~ 50% di necrosi dopo 10 giorni se conservato non trattato. Con l'aiuto di intravitale microscopia a fluorescenza, questo modello da camera permette la visualizzazione ripetitiva dimorfologia e l'emodinamica in diverse regioni di interesse nel corso del tempo. Processi associati, quali l'apoptosi, infiammazione, perdite microvascolare e l'angiogenesi possono essere studiati e correlati alle analisi di proteine immunoistochimica e molecolare. Fino ad oggi, il modello ha dimostrato la fattibilità e la riproducibilità in diversi studi sperimentali pubblicati che indagano l'effetto di pre-, peri- e postcondizionamento del tessuto ischemically sfidato.
Introduction
Copertura del materiale esposto tendini, osso e impianto nella chirurgia ricostruttiva si basa sull'utilizzo di lembi. Un lembo è un blocco di tessuto che viene trasferito sul suo peduncolo vascolare che garantisce l'afflusso arterioso e deflusso venoso. Nonostante competenze ampio e la disponibilità di una varietà di lembi da trasferire, complicazioni ischemia indotta vanno dalla ripartizione ferita alla perdita totale del tessuto sono ancora incontrati. Considerando che il trattamento conservativo e la guarigione per seconda intenzione si può aspettare dopo la necrosi dei tessuti minore, significativa necrosi lembo di solito richiede una revisione chirurgica, tra cui debridement, condizionata della ferita e la ricostruzione secondaria. Questo aumenta la morbilità, prolunga degenza e di conseguenza porta ad un aumento dei costi di assistenza sanitaria.
Flaps con un pattern indefinito di vasi o aree perfusi a caso nella zona distale più lontano dal flusso arterioso sono particolarmente inclini a danno ischemico. Acco rdingly, numerosi studi sperimentali e clinici hanno valutato lo sviluppo di necrosi in entrambi, lembi modello assiale (apporto di sangue definito) e lembi di pattern casuale (apporto di sangue non definita) 1-3. I risultati principali sono comunemente basati sulla valutazione macroscopica della dimensione dell'area necrotica. Per valutare le cause ei meccanismi di necrosi tissutale più in dettaglio, numerosi studi focalizzati sull'analisi del microcircolo. Diverse tecniche sono state usate per misurare la perfusione dei tessuti, compresa l'analisi della tensione di ossigeno tissutale utilizzando elettrodi polarografiche 4-5, nonché la misurazione del flusso sanguigno mediante laser Doppler flussimetria 6-7, tintura diffusione 8, e microsfere 9-10. Queste tecniche, tuttavia, consentono solo per misurare parametri indiretti di perfusione tissutale e non consentono alcuna analisi morfologica dei processi microhemodynamic all'interno di una singola area di interesse di un lembo.
t "> Sandison si caratterizza per essere il primo che ha utilizzato una camera trasparente per prolungato in vivo, che aveva svolto in conigli 11 Nel 1943 -. circa 20 anni dopo – Algire fu il primo ad adattare una camera così trasparente applicabile nei topi per studiare il comportamento di micro-impianti di cellule tumorali 12. A causa del fatto che i topi sono i cosiddetti animali pelle libera e dopo alcuni parametri tecnici negli anni successivi, Lehr e collaboratori sono stati in grado di adattare tale dorsale camera plica sviluppare una camera di titanio più piccolo e leggero. Questa camera di abilitare valutazione mediante microscopia a fluorescenza intravitale, una tecnica che permette la visualizzazione diretta e ripetitivo di una serie di caratteristiche morfologiche e microcircolo e loro evoluzione nel tempo in diverse condizioni fisiologiche e fisiopatologiche, tale come danno da ischemia-riperfusione 13.Nell'inchiesta di perfusion di pelle, muscoli e ossa lembi in condizioni normali e patologiche due tendenze si è verificato: In primo luogo, i modelli a ribalta "acuti" che non utilizzano la camera plica dorsale come il padiglione auricolare peduncolato nel topo 14, il lembo cutaneo isola basato lateralmente nel criceto 15 e il lembo composito peduncolato nel ratto 16. In secondo luogo, il modello flap "cronica", in cui la combinazione di un lembo con una plica dorsale camera permessi microcircolo ripetitivo analisi per diversi giorni con microscopia a fluorescenza intravitale. È costituito da un lembo muscolocutaneo perfuso casuale che è integrato nella camera plica del mouse 17. Il rapporto tra larghezza e lunghezza è stato scelto che una situazione di ischemia persistente acuta si traduce costantemente in ~ 50% necrosi del tessuto lembo 10 a 14 giorni dopo il sollevamento del lembo. Questa misura riproducibile di necrosi tissutale permette un'ulteriore valutazione di entrambi, protezione (cioè, lo sviluppo di less necrosi) e fattori negativi (ad esempio, sviluppo di più di necrosi) sulla fisiopatologia patta. Negli ultimi anni, diverse pubblicazioni sperimentali che dimostrano l'effetto di diversi pre-, peri- e le procedure post-condizionamento, compresa la somministrazione di sostanze di tessuto-protezione 18-24 e l'applicazione locale di fattori di stress fisiologici come il calore 25 e 26 onde d'urto, sono emerse.
Le analisi quantitative di necrosi, microvascolare morfologia e parametri microcircolatori possono inoltre essere correlate ad analisi immunoistochimica e saggi di proteine. Diverse proteine e molecole, tra cui il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), ossido nitrico sintasi (NOS), fattore nucleare kappa B (NF-kB) e le proteine da shock termico (HSP-32: eme-ossigenasi 1 (HO-1) e HSP- 70) hanno dimostrato di giocare un ruolo nella protezione dei tessuti. Sulla base di questo modello lembo camera, due modifiche sono state sviluppate in order per analizzare la neovascolarizzazione e la microcircolazione della pelle durante il trapianto di guarigione 27 e gli sviluppi angiogenici in un lembo peduncolato con motivo assiale perfusione 28. Vi presentiamo un modello riproducibile e affidabile che include un lembo muscolocutaneo ischemically contestato nella camera del mouse plica. Questo modello permette la visualizzazione e la quantificazione del microcircolo e l'emodinamica da intravitale microscopia a fluorescenza.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per ridurre le complicanze ischemiche e quindi migliorare l'esito clinico, è necessaria una conoscenza più dettagliata dei processi fisiopatologici in tessuto lembo critico perfusi. Lo sviluppo di nuovi modelli animali che imitano l'ischemia persistente acuta è quindi obbligatoria. Di conseguenza, siamo stati in grado di sviluppare un modello facilmente riproducibile e affidabile che consente per la valutazione ripetitive in tempo reale morfologica, dinamica e funzionale dei vari parametri di muscoli e vascol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Katharina Haberland per l'editing di immagini. Finanziamento: L'anziano autore ha ricevuto una sovvenzione KKF dalla Technische Universität München di istituire un nuovo laboratorio di ricerca.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| C57Bl/6 mice 6-8w 20-22g | Charles River | ||
| depilation cream | Veet | any depilation cream | |
| titanium chamber | Irola | 160001 | Halteblech M |
| slotted cheese head screw | Screws and More | 842210 | DIN84 M2x10 |
| hexagon full nut | Screws and More | 93422 | DIN934 M2 |
| snap ring | Schaefer-Peters | 472212 | DIN472 J12x1,0 |
| cover glass | Volab | custom-made cover glass 11,8mm in diameter | |
| fixing foam | tesamoll | 05559-100 | tesamoll Standard I-Profile |
| ketamine hydrochloride | Parke Davis | Ketavet® | |
| dihydroxylidinothiazine hydrochloride | Bayer | Rompun® | |
| Buprenorphin | Essex Pharma | Temgesic® | |
| Saline 0,9% | |||
| desinfection alcohol | |||
| Vicryl 5-0 | Ethicon | V 490 H | |
| Ethilon 5-0 | Ethicon | EH 7823 H | |
| 1ml syringes | |||
| surgical skin marker with flexible ruler | Purple surgical | PS3151 | any surgical skin marker and flexible ruler |
| pointed scissors | |||
| Micro-Scissors | |||
| normal scissors | |||
| 2 clamps | |||
| fine anatomic forceps | |||
| micro-forceps | |||
| hex nuter driver | wiha | 1018 | |
| screwdriver | wiha | 685 | |
| snap ring plier | Knipex | 4411J1 | 12-25mm |
| wire cutter | Knipex | 70 02 160 | Wire cutter is used to cut screws short; 160mm |
| trans-illumination light | IKEA | 501.632.02 | LED light Jansjö; any light |
| magnification glasses | |||
| intravital microscope | Zeiss | 490035-0001-000 | Scope.A1.Axiotech |
| LED system | Zeiss | 423052-9501-000 | Colibri.2 |
| LED module 365nm | Zeiss | 423052-9011-000 | |
| LED module 470nm | Zeiss | 423052-9052-000 | |
| LED module 540-580nm | Zeiss | 423052-9121-000 | |
| Filter set 62 62 HE BFP + GFP + HcRed | Zeiss | 489062-9901-000 | range 1: 350-390nm excitation wavelength split 395 / 402-448nm; range 2: 460-488nm, split 495nm / 500-557nm; range 3: 567-602nm, split 610nm / 615-infinite |
| Filter set 20 Rhodamine | Zeiss | 485020-0000-000 | 540-552nm, split 560, emission 575-640nm |
| 2,5x objective NA=0,06 | Zeiss | 421020-9900-000 | A-Plan 2,5x/0.06 |
| 5x objective NA=0,16 | Zeiss | 420330-9901-000 | EC Plan-Neofluar 5x/0.16 M27 |
| 10x objetive NA=0,30 | Zeiss | 420340-9901-000 | EC Plan-Neofluar 10x/0.30 M27 |
| 20x objective NA=0.50 | Zeiss | 420350-9900-000 | EC Plan-Neofluar 20x/0.50 M27 |
| 50x objective NA=0,55 | Zeiss | 422472-9960-000 | LD Epiplan-Neofluar 50x/0.55 DIC 27 |
| ZEN imaging software | Zeiss | ZenPro 2012 | |
| CapImage | Dr. Zeintl | ||
| Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | 45946 | |
| bisBenzimide H 33342 trihydrochloride | Sigma-Aldrich | B2261 | harmful if swallowed; causes severe skin burns and eye damage, may cause repiratory irritat |
| Rhodamine 6G chloride | Invitrogen | R634 | harmful if swallowed; may cause genetic defects; may cause cancer; may damage fertility or the unborn child |
| Pentobarbital | Merial | Narcoren® |
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