Ишемическая тканей Травмы в спинной кожной складки палаты Mouse: кожный лоскут модель для изучения Острая стойких ишемии
Summary
Окно мышиного спинной кожной складки камеры, представленной визуализирует зону острого упорной ишемии мышечного лоскута. Прижизненные разрешения микроскопии эпи-флуоресценции для прямого и повторяющихся оценки микрососудов и количественной оценки гемодинамики. Морфологические и гемодинамики результаты также могут быть связаны с гистологических и молекулярных анализов.
Abstract
Несмотря глубокой экспертизы и передовых хирургических методов, вызванного ишемией осложнений, начиная от ран пробоя некроза обширной ткани по-прежнему происходят, особенно в реконструктивной хирургии лоскута. Несколько экспериментальных моделей закрылков были разработаны для анализа основных причин и механизмов и исследовать стратегии лечения для предотвращения ишемических осложнений. Сдерживающим фактором для большинства моделей является отсутствие возможности непосредственно и повторно визуализировать микрососудистую архитектуры и гемодинамики. Цель протокола было представить устоявшуюся модель мыши присоединения этих прежде упомянутые недостающие элементы. Тяжелее др. Разработали модель мышечного лоскута со случайным перфузии рисунком, который подвергается острой постоянную ишемию и результаты в ~ некроза на 50% через 10 дней, если хранятся лечить. С помощью прижизненной эпи-флуоресцентной микроскопии, эта камера модель позволяет повторяющийся визуализациюМорфология и гемодинамика в различных регионах, представляющих интерес с течением времени. Сопутствующие процессы, такие как апоптоз, воспаление, утечки микрососудов и ангиогенеза могут быть исследованы и коррелирует с иммуногистохимических и молекулярных белковых анализов. На сегодняшний день, эта модель доказала целесообразность и воспроизводимость в нескольких опубликованных экспериментальных исследований, изучающих влияние пре-, пери- и посткондиционирования ишемией оспариваемого ткани.
Introduction
Охват подвергаются сухожилия, кости и имплантата материала в реконструктивной хирургии опирается на использование закрылков. Заслонка блок ткани, которая передается на ее сосудистой ножки, что гарантирует артериальное приток и венозный отток. Несмотря на широкое экспертизы и наличия различных лоскутов, зачисляемые, вызванного ишемией осложнений, начиная от ран пробоя к полной потере тканей по-прежнему встречаются. В то время как консервативное лечение и исцеление вторичным натяжением можно ожидать после некроза незначительной ткани, значительное некроз лоскута обычно требуется хирургического вмешательства, в том числе хирургической обработки раны, раны кондиционирования и вторичной реконструкции. Это повышает заболеваемость, продлевает пребывание в больнице и, следовательно, приводит к увеличению расходов на здравоохранение.
Клапаны с неопределенной структуре сосудистой или случайно перфузированных областях в дистальной зоне наиболее удаленной от притока артериальной особенно склонны к ишемии. Акко rdingly, многочисленные экспериментальные и клинические исследования оценивали развитие некроза в оба, осевая картина закрылки (определяется кровоснабжение) и случайным образом закрылки (определено кровоснабжение) 1-3. Основные результаты, как правило, основаны на макроскопической оценки размера зоны некроза. Для того, чтобы оценить причины и механизмы некроза тканей более подробно, в нескольких исследованиях сосредоточено на анализе микроциркуляции. Различные методы были использованы для измерения тканевой перфузии, в том числе при анализе тканей напряжения кислорода с использованием полярографические электроды 4-5, а также измерением кровотока при помощи лазерной доплеровской флоуметрии 6-7, диффузию красителя 8, и микросферы 9-10. Эти методы, однако, только позволяют для измерения параметров косвенные тканевой перфузии и не дать возможность любому морфологического анализа microhemodynamic процессов внутри отдельной области, представляющей интерес лоскута.
т "> Сандисон, как известно, первым, кто использовал прозрачный камеру для продлен в естественных условиях исследования, которые он совершал в кроликов 11 В 1943 -. около 20 лет спустя – Algire был первым адаптировать такую прозрачную камеру для применения у мышей с целью изучения поведения микро-имплантаты опухолевых клеток 12. В связи с тем, что мыши, которые так называемого дряблая кожа животных и после некоторых технических уточнений в течение последующих лет, Лер и сотрудники смогли адаптироваться такие Спинной кожной складки камера разрабатывает меньше и легче титана камеру. Эта камера включена оценка с помощью прижизненной флуоресцентной микроскопии, технику, обеспечивающую прямое и повторяющийся визуализацию ряда морфологических и микроциркуляторных особенностей и их изменений во времени при различных физиологических и патофизиологических условиях, например как ишемии-реперфузии травмы 13.При исследовании реrfusion из кожи, мышечных и костных лоскутов при нормальных и патологических условиях две тенденции произошло: во-первых, "острые" модели закрылков, которые не используют в спинной кожной складки камеру, таких как pedicled уха заслонки в мыши 14, в поперечном направлении, основанный лоскут остров кожи в хомяка 15 и pedicled сложного лоскута у крыс 16. Во-вторых, "хронический" лоскут модель, где сочетание клапаном с камеры позволяет спинной кожной складки повторяющихся микроциркуляции анализирует в течение нескольких дней с прижизненной флуоресцентной микроскопии. Он состоит из беспорядочно перфузии мышечный лоскут, который интегрирован в кожной складки камере мыши 17. Его отношение ширины к длине было выбрано, что ситуация острого упорной ишемии последовательно приводит в ~ некроза лоскута ткани 50% от 10 до 14 дней после закрылков высоте. Это воспроизводимая степень некроза тканей позволяет дальнейшую оценку и защитные (т.е. развитие леы некроз) и вредные факторы (то есть, развитие более некроза) на закрылков патофизиологии. В последние годы, несколько экспериментальных публикации, демонстрирующие эффект различной пре-, пери- и процедур пост-кондиционирования, в том числе администрации тканей-защитная веществ 18-24 и местного применения физиологических факторов стресса, таких как тепловой 25 и ударных волн 26, появились.
Количественные анализы некроза, микрососудистой морфологии и микроциркуляции параметров дополнительно могут быть соотнесены с иммуногистохимических анализов и белкового анализа. Различные белки и молекулы в том числе фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), азотной синтазы оксида (NOS), ядерный фактор каппа В (NF-kB) и белков теплового шока (HSP-32: гем-оксигеназы 1 (HO-1) и HSP- 70) было показано, играют важную роль в защите тканей. На основе этой модели камера закрылка, две модификации были разработаны в Ордг проанализировать образование новых сосудов и микроциркуляции во кожей трансплантата исцеления 27 и кровеносных сосудов разработок в pedicled лоскута с осевым образов перфузии 28. Мы представляем воспроизводимую и надежную модель, которая включает в себя ишемически оспариваемый мышечный лоскут в мышь кожной складки камеры. Эта модель позволяет визуализировать и количественно микроциркуляции и гемодинамики по прижизненной эпи-флуоресцентной микроскопии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для того чтобы уменьшить ишемических осложнений и тем самым улучшить клинические результаты, более детальное знание патофизиологических процессов в критическом перфузии лоскута ткани требуется. Разработка новых моделей на животных, которые имитируют острый постоянную ишемию Поэто?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Katharina Хаберланд для редактирования изображений. Финансирование: старший автор получил KKF Грант из Technische Universität München, чтобы создать новую исследовательскую лабораторию.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| C57Bl/6 mice 6-8w 20-22g | Charles River | ||
| depilation cream | Veet | any depilation cream | |
| titanium chamber | Irola | 160001 | Halteblech M |
| slotted cheese head screw | Screws and More | 842210 | DIN84 M2x10 |
| hexagon full nut | Screws and More | 93422 | DIN934 M2 |
| snap ring | Schaefer-Peters | 472212 | DIN472 J12x1,0 |
| cover glass | Volab | custom-made cover glass 11,8mm in diameter | |
| fixing foam | tesamoll | 05559-100 | tesamoll Standard I-Profile |
| ketamine hydrochloride | Parke Davis | Ketavet® | |
| dihydroxylidinothiazine hydrochloride | Bayer | Rompun® | |
| Buprenorphin | Essex Pharma | Temgesic® | |
| Saline 0,9% | |||
| desinfection alcohol | |||
| Vicryl 5-0 | Ethicon | V 490 H | |
| Ethilon 5-0 | Ethicon | EH 7823 H | |
| 1ml syringes | |||
| surgical skin marker with flexible ruler | Purple surgical | PS3151 | any surgical skin marker and flexible ruler |
| pointed scissors | |||
| Micro-Scissors | |||
| normal scissors | |||
| 2 clamps | |||
| fine anatomic forceps | |||
| micro-forceps | |||
| hex nuter driver | wiha | 1018 | |
| screwdriver | wiha | 685 | |
| snap ring plier | Knipex | 4411J1 | 12-25mm |
| wire cutter | Knipex | 70 02 160 | Wire cutter is used to cut screws short; 160mm |
| trans-illumination light | IKEA | 501.632.02 | LED light Jansjö; any light |
| magnification glasses | |||
| intravital microscope | Zeiss | 490035-0001-000 | Scope.A1.Axiotech |
| LED system | Zeiss | 423052-9501-000 | Colibri.2 |
| LED module 365nm | Zeiss | 423052-9011-000 | |
| LED module 470nm | Zeiss | 423052-9052-000 | |
| LED module 540-580nm | Zeiss | 423052-9121-000 | |
| Filter set 62 62 HE BFP + GFP + HcRed | Zeiss | 489062-9901-000 | range 1: 350-390nm excitation wavelength split 395 / 402-448nm; range 2: 460-488nm, split 495nm / 500-557nm; range 3: 567-602nm, split 610nm / 615-infinite |
| Filter set 20 Rhodamine | Zeiss | 485020-0000-000 | 540-552nm, split 560, emission 575-640nm |
| 2,5x objective NA=0,06 | Zeiss | 421020-9900-000 | A-Plan 2,5x/0.06 |
| 5x objective NA=0,16 | Zeiss | 420330-9901-000 | EC Plan-Neofluar 5x/0.16 M27 |
| 10x objetive NA=0,30 | Zeiss | 420340-9901-000 | EC Plan-Neofluar 10x/0.30 M27 |
| 20x objective NA=0.50 | Zeiss | 420350-9900-000 | EC Plan-Neofluar 20x/0.50 M27 |
| 50x objective NA=0,55 | Zeiss | 422472-9960-000 | LD Epiplan-Neofluar 50x/0.55 DIC 27 |
| ZEN imaging software | Zeiss | ZenPro 2012 | |
| CapImage | Dr. Zeintl | ||
| Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | 45946 | |
| bisBenzimide H 33342 trihydrochloride | Sigma-Aldrich | B2261 | harmful if swallowed; causes severe skin burns and eye damage, may cause repiratory irritat |
| Rhodamine 6G chloride | Invitrogen | R634 | harmful if swallowed; may cause genetic defects; may cause cancer; may damage fertility or the unborn child |
| Pentobarbital | Merial | Narcoren® |
References
- McFarlane, R., De Young, G., Henry, R. The design of a pedicle flap in the rat to study necrosis and its prevention. Plast Reconstr Surg. 35, 177-182 (1965).
- Finseth, F., Cutting, C. An experimental neurovascular island skin flap for the study of the delay phenomenon. Plast Reconstr Surg. 61, 412-420 (1978).
- Petry, J. J., Wortham, K. A. The anatomy of the epigastric flap in the experimental rat. Plast Reconstr Surg. 74, 410-413 (1984).
- Achauer, B. M., Black, K. S., Litke, D. K. Transcutaneous PO2 in flaps: a new method of survival prediction. Plast Reconstr Surg. 65, 45-45 (1980).
- Vollmar, B., Menger, M. D. Assessment of microvascular oxygen supply and tissue oxygenation in hepatic ischemia/reperfusion. Adv. Exp. Med. Biol. 428, 403-408 (1997).
- Menger, M. D., Barker, J. H., Messmer, K. Capillary blood perfusion during postischemic reperfusion in striated muscle. Plast Reconstr Surg. 89, 1104-1114 (1992).
- Uhl, E., Rösken, F., Curri, S. B., Menger, M. D., Messmer, K. Reduction of skin flap necrosis by transdermal application of buflomedil bound to liposomes. Plast Reconstr Surg. 102, 1598-1604 (1998).
- Pang, C. Y., Neligan, P., Nakatsuka, T., Sasaki, G. H. Assessment of the fluorescein dye test for prediction of skin flap viability in pigs. J Surg Res. 41, 173-181 (1986).
- Hjortdal, V. E., Hansen, E. S., Henriksen, T. B., Kjolseth, D., Soballe, K., Djurhuus, J. C. The microcirculation of myocutaneous island flaps in pigs studied with radioactive blood volume tracers and microspheres of different sizes. Plast Reconstr Surg. 89, 116-122 (1992).
- Pang, C. Y., Neligan, P., Nakatsuka, T. Assessment of microsphere technique for measurement of capillary blood flow in random skin flaps in pigs. Plast Reconstr Surg. 74, 513-521 (1984).
- Sandison, J. C. A new method for the microscopic study of living growing tissues by the introduction of a transparent chamber in the rabbit’s ear. The Anatomical Record. 28, 281-287 (1924).
- Algire, G. H. An Adaptation of the Transparent-Chamber Technique to the Mouse. Journal of the National Cancer Institute. 4, 1-11 (1943).
- Lehr, H. A., Leunig, M., Menger, M. D., Nolte, D., Messmer, K. Dorsal skinfold chamber technique for intravital microscopy in nude mice. Am J Pathol. 4, 1055-1062 (1993).
- Barker, J. H., et al. An animal model to study microcirculatory changes associated with vascular delay. Br J Plast Surg. 52, 133-142 (1999).
- Erni, D., Sakai, H., Banic, A., Tschopp, H. M., Intaglietta, M. Quantitative assessment of microhemodynamics in ischemic skin flap tissue by intravital microscopy. Ann Plast Surg. 43, 405-414 (1999).
- Roesken, F., Schäfer, T., Spitzer, W. J., Vollmar, B., Menger, M. D. In vivo analysis of the microcirculation of osteomyocutaneous flaps using fluorescence microscopy. Br J Plast Surg. 52, 644-652 (1999).
- Harder, Y., Amon, M., Erni, D., Menger, M. D. Evolution of ischemic tissue injury in a random pattern flap: a new mouse model using intravital microscopy. J Surg Res. 121, 197-205 (2004).
- Harder, Y., Contaldo, C., Klenk, J., Banic, A., Jakob, S. M., Erni, D. Preconditioning with monophosphoryl lipid A improves survival of critically ischemic tissue. Anesth Analg. 100, 1786-1792 (2005).
- Rezaeian, F., et al. Erythropoieton protects critically perfused flap tissue. Ann Surg. 248, 919-929 (2008).
- Harder, Y., et al. Erythropoietin reduces necrosis in critically ischemic myocutaneous tissue by protecting nutritive perfusion in a dose-dependent manner. Surgery. 145, 10-1016 (2009).
- Rezaeian, F., et al. Erythropoietin-induced upregulation of endothelial nitric oxide synthase but not vascular endothelial growth factor prevents musculocutaneous tissue from ischemic damage. Lab Invest. 90, 40-51 (2010).
- Rezaeian, F., Ong, M. F., Harder, Y., Menger, M. D. N-acetylcysteine attenuates leukocytic inflammation and microvascular perfusion failure in critically ischemic random pattern flaps. Microvasc Res. 82, 28-34 (2011).
- Rezaeian, F., et al. Ghrelin protects musculocutaneous tissue from ischemic necrosis by improving microvascular perfusion. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302, 603-610 (2012).
- Rezaeian, F., et al. Long-term preconditioning with Erythropoietin reduces ischemia-induced skin necrosis. Microcirculation. , (2013).
- Harder, Y., et al. Heat shock preconditioning reduces ischemic tissue necrosis by heat shock protein (HSP)-32-mediated improvement of the microcirculation rather than induction of ischemic tolerance. Ann Surg. 242, 869-878 (2005).
- Tobalem, M., et al. Local shockwave-induced capillary recruitment improves survival of musculocutaneous flaps. J Surg Res. 184, 1196-1204 (2013).
- Lindenblatt, N., Calcagni, M., Contaldo, C., Menger, M. D., Giovanoli, P., Vollmar, B. A new model for studying the revascularization of skin grafts in vivo: the role of angiogenesis. Plast Reconstr Surg. 122, 169-1680 (2008).
- Schweizer, R., et al. Morphology and hemodynamics during vascular regeneration in critically ischemic murine skin studied by intravital microscopy techniques. Eur Surg Res. 47, 222-230 (2011).
- Klyscz, T., Jünger, M., Jung, F., Zeintl, H. Cap image—a new kind of computer-assisted video image analysis system for dynamic capillary microscopy. Biomed. Tech. 42, 168-1675 (1997).
- Gross, J. F., Aroesty, J. Mathematical models of capillary flow: a critical review. Biorheology. 9, 225-264 (1972).
- Menger, M. D., Pelikan, S., Steiner, D. Microvascular ischemiareperfusion injury in striated muscle: significance of ‘reflow paradox. Am J Physiol. 263 (6 part 2), 1901-1906 (1992).
