Ischämischen Gewebeschädigung des Rückenhautkammer der Maus: Ein Hautlappen Modell zu Akute Persistent Ischämie Untersuchen
Summary
Das Fenster des murinen Rückenhautkammer dargestellt visualisiert eine Zone von akuter Ischämie persistent eines muskulokutanen Klappe. Intravital Epifluoreszenzmikroskopie Genehmigungen für direkte und wiederholte Bewertung der Mikrogefäß und Quantifizierung der Hämodynamik. Morphologische und hämodynamische Ergebnisse kann weiter mit histologischen und molekularen Analysen korreliert werden.
Abstract
Trotz tiefen Erfahrung und die moderne Operationstechniken werden Ischämie-induzierten Komplikationen reichen von Wund Aufschlüsselung umfangreiche Gewebsnekrose noch auftritt, vor allem in der rekonstruktiven Klappenchirurgie. Mehrere experimentelle Klappenmodelle wurden entwickelt, um die Ursachen und Mechanismen zu analysieren und Behandlungsstrategien zu untersuchen, um ischämische Komplikationen zu verhindern. Der limitierende Faktor der meisten Modelle ist die fehlende Möglichkeit, mikrovaskuläre Architektur und Hämodynamik direkt und wiederholt zu visualisieren. Das Ziel des Protokolls war es, ein gut etabliertes Mausmodell Gunter diese bereits erwähnt fehlt Elemente präsentieren. Härtere et al. Haben ein Modell eines musculocutaneus Klappe mit einem zufälligen Perfusion Muster, das akute persistent Ischämie und Ergebnisse in ~ 50% Nekrose nach 10 Tagen, wenn unbehandelt gehalten erfährt entwickelt. Mit Hilfe der intravital Epifluoreszenzmikroskopie ermöglicht dieses Modell Kammer wiederholende VisualisierungMorphologie und Hämodynamik in verschiedenen Regionen von Interesse über die Zeit. Verbundenen Prozesse wie Apoptose, Entzündung und Angiogenese mikrovaskulären Leckage untersucht und immunhistochemische und molekular Protein-Assays korreliert werden. Bis heute hat das Modell Durchführbarkeit und Reproduzierbarkeit in mehreren veröffentlichten experimentellen Studien zur Untersuchung der Wirkung von prä-, peri- und Postkonditionierung ischämisch fochten Gewebe bewährt.
Introduction
Abdeckung der freiliegenden Sehnen, Knochen und Implantatmaterial in der rekonstruktiven Chirurgie beruht auf der Verwendung von Klappen. Eine Klappe ist ein Block von Gewebe, das an seiner Gefäßstiel, der arteriellen Zustroms und eines venösen Abflusses garantiert übertragen wird. Trotz breiten Know-how und die Verfügbarkeit von einer Vielzahl von Klappen zu übertragen ist, werden Ischämie-induzierten Komplikationen reichen von Wund Aufschlüsselung der Gesamtgewebeverlust noch angetroffen. Während konservative Behandlung und Heilung durch sekundäre Absicht kann nach kleineren Gewebsnekrose erwarten, signifikante Lappennekrose erfordert in der Regel chirurgische Revision, einschließlich Debridement, Wundanlage und sekundäre Rekonstruktion. Dies erhöht die Morbidität, verlängert Krankenhausaufenthalt und damit zu erhöhten Kosten im Gesundheitswesen.
Klappen mit einem undefinierten Muster Vaskulatur oder zufällig perfundiert Bereiche in dem distalen Bereich der am weitesten von der arteriellen Zustrom sind besonders anfällig für ischämische Schädigung. Acco rdingly wurden zahlreiche experimentelle und klinische Studien, die Entwicklung der Nekrose sowohl ausgewertet, axialen Musterklappen (definiert Blutversorgung) und Zufallsmuster Klappen (undefined Blutversorgung) 1-3. Die wichtigsten Ergebnisse sind häufig auf makroskopische Auswertung der Größe des nekrotischen Bereich basiert. Um die Ursachen und Mechanismen der Gewebenekrose beurteilen näher konzentrierte mehrere Studien auf der Analyse der Mikrozirkulation. Verschiedene Techniken wurden eingesetzt, um die Gewebedurchblutung zu messen, einschließlich der Analyse von Gewebesauerstoffspannung mit polarographischen Elektroden 4-5, sowie die Messung der Blutströmung unter Verwendung der Laser-Doppler-Flussmessung 6-7, Farbstoffdiffusions 8 und 9-10 Mikrokügelchen. Diese Techniken sind jedoch nur für Mess indirekte Parameter der Gewebedurchblutung zu ermöglichen und keine morphologischen Analyse der microhemodynamic Prozesse innerhalb eines einzelnen interessierenden Bereich einer Klappe zu ermöglichen.
t "> Sandison ist bekannt, dass der erste, der eine transparente Kammer eingesetzt hat für die in vivo Studien, die er bei Kaninchen 11 geführt verlängert sein 1943 -. etwa 20 Jahre später – Algire war der erste, wie eine transparente Kammer anzupassen anwendbar zu sein bei Mäusen, um das Verhalten von Mikroimplantate von Tumorzellen 12 zu studieren. Aufgrund der Tatsache, dass Mäuse sind so genannte lose Haut Tieren und nach einigen technischen Raffinessen in den folgenden Jahren waren Lehr und Mitarbeiter in der Lage, sich anzupassen wie eine Rückenhautkammer der Entwicklung eines kleineren und leichteren Titankammer. Diese Kammer aktiviert Auswertung mittels Intravitalfluoreszenzmikroskopie, eine Technik, die direkten und wiederholenden Darstellung von einer Reihe von morphologischen und Mikrozirkulationsmerkmale und deren Veränderungen im Laufe der Zeit unter verschiedenen physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen ermöglicht, wie Ischämie-Reperfusionsschaden 13.Bei der Untersuchung von PErfusion von Haut, Muskeln und Knochen Klappen unter normalen und pathologischen Bedingungen zwei Trends aufgetreten: Erstens, die "akut" Klappe Modelle, die nicht die Rückenhautkammer verwenden wie die gestielten Ohrenklappe in der Maus 14, die seitlich auf der Basis Insel Hautlappen im Hamster 15 und der Verbund gestielten Lappen bei der Ratte 16. Zweitens, die "chronische" Klappe Modell, bei dem die Kombination von einer Klappe mit einer Rückenhautkammer erlaubt wiederholende Mikrozirkulation über mehrere Tage mit Intravitalfluoreszenzmikroskopie analysiert. Es besteht aus einem zufällig perfundiert muskulokutanen Klappe, die in der Hautkammer der Maus 17 integriert ist. Seine Breite-zu-Länge-Verhältnis wurde gewählt, dass eine Situation der akuten persistent Ischämie führt durchweg in ~ 50% Klappen Gewebsnekrose 10 bis 14 Tage nach Lappenhebung. Diese reproduzierbare Ausmaß der Gewebsnekrose ermöglicht die weitere Auswertung der beiden, Schutz (dh Entwicklung less Nekrose) und schädlichen Faktoren (dh Entwicklung von mehr Nekrose) auf der Klappe Pathophysiologie. In den letzten Jahren wurden mehrere experimentelle Publikationen, die die Wirkung von verschiedenen prä-, peri- und postKonditionierungsVerfahren, einschließlich der Verabreichung von Tissue-Schutzsubstanzen 18-24 und der lokalen Anwendung der physiologischen Stressfaktoren wie Wärmeschockwellen 25 und 26, entstanden.
Die quantitativen Analysen der Nekrose, mikrovaskulären Morphologie und Mikrozirkulationsparameter kann weiter auf immunhistochemischen Analysen und Protein-Assays korreliert werden. Verschiedene Proteine und Moleküle, einschließlich vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF), Stickstoffmonoxid-Synthasen (NOS), Nuklearfaktor kappa B (NF-kB), und Hitzeschockproteinen (HSP-32: Häm-Oxygenase-1 (HO-1) und HSP- 70) haben gezeigt, dass eine Rolle bei der Gewebeschutz spielen. Auf der Grundlage dieser Kammer Klappe Modell wurden zwei Modifikationen in orde entwickeltr zu Neovaskularisation und Mikrozirkulation während Hauttransplantation Heilung 27 und angiogene Entwicklungen in einem gestielten Klappe mit axialen Muster Perfusion 28 zu analysieren. Wir präsentieren eine reproduzierbare und zuverlässige Modell, das eine ischämisch fochten musculocutaneus Klappe in der Maus Hautkammer enthält. Dieses Modell ermöglicht die Visualisierung und Quantifizierung der Mikrozirkulation und die Hämodynamik durch Intravital Auflicht-Fluoreszenz-Mikroskopie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um ischämischen Komplikationen zu verringern und dadurch die Verbesserung der klinischen Ergebnisse wird genauere Kenntnis der pathophysiologischen Prozesse bei kritisch durchbluteten Gewebeklappe erforderlich. Die Entwicklung neuer Tiermodelle, die akute persistent Ischämie imitieren ist daher zwingend. Dementsprechend konnten wir eine leicht reproduzierbare und zuverlässige Modell erlaubt für sich wiederholende morphologischen, dynamische und funktionale Echtzeit-Auswertung der verschiedenen Parameter des Muskel- …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Katharina Haberland für die Bildbearbeitung. Finanzierung: Der leitende Autor erhielt eine KKF Zuschuss der Technischen Universität München die Einrichtung eines neuen Forschungslabor.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| C57Bl/6 mice 6-8w 20-22g | Charles River | ||
| depilation cream | Veet | any depilation cream | |
| titanium chamber | Irola | 160001 | Halteblech M |
| slotted cheese head screw | Screws and More | 842210 | DIN84 M2x10 |
| hexagon full nut | Screws and More | 93422 | DIN934 M2 |
| snap ring | Schaefer-Peters | 472212 | DIN472 J12x1,0 |
| cover glass | Volab | custom-made cover glass 11,8mm in diameter | |
| fixing foam | tesamoll | 05559-100 | tesamoll Standard I-Profile |
| ketamine hydrochloride | Parke Davis | Ketavet® | |
| dihydroxylidinothiazine hydrochloride | Bayer | Rompun® | |
| Buprenorphin | Essex Pharma | Temgesic® | |
| Saline 0,9% | |||
| desinfection alcohol | |||
| Vicryl 5-0 | Ethicon | V 490 H | |
| Ethilon 5-0 | Ethicon | EH 7823 H | |
| 1ml syringes | |||
| surgical skin marker with flexible ruler | Purple surgical | PS3151 | any surgical skin marker and flexible ruler |
| pointed scissors | |||
| Micro-Scissors | |||
| normal scissors | |||
| 2 clamps | |||
| fine anatomic forceps | |||
| micro-forceps | |||
| hex nuter driver | wiha | 1018 | |
| screwdriver | wiha | 685 | |
| snap ring plier | Knipex | 4411J1 | 12-25mm |
| wire cutter | Knipex | 70 02 160 | Wire cutter is used to cut screws short; 160mm |
| trans-illumination light | IKEA | 501.632.02 | LED light Jansjö; any light |
| magnification glasses | |||
| intravital microscope | Zeiss | 490035-0001-000 | Scope.A1.Axiotech |
| LED system | Zeiss | 423052-9501-000 | Colibri.2 |
| LED module 365nm | Zeiss | 423052-9011-000 | |
| LED module 470nm | Zeiss | 423052-9052-000 | |
| LED module 540-580nm | Zeiss | 423052-9121-000 | |
| Filter set 62 62 HE BFP + GFP + HcRed | Zeiss | 489062-9901-000 | range 1: 350-390nm excitation wavelength split 395 / 402-448nm; range 2: 460-488nm, split 495nm / 500-557nm; range 3: 567-602nm, split 610nm / 615-infinite |
| Filter set 20 Rhodamine | Zeiss | 485020-0000-000 | 540-552nm, split 560, emission 575-640nm |
| 2,5x objective NA=0,06 | Zeiss | 421020-9900-000 | A-Plan 2,5x/0.06 |
| 5x objective NA=0,16 | Zeiss | 420330-9901-000 | EC Plan-Neofluar 5x/0.16 M27 |
| 10x objetive NA=0,30 | Zeiss | 420340-9901-000 | EC Plan-Neofluar 10x/0.30 M27 |
| 20x objective NA=0.50 | Zeiss | 420350-9900-000 | EC Plan-Neofluar 20x/0.50 M27 |
| 50x objective NA=0,55 | Zeiss | 422472-9960-000 | LD Epiplan-Neofluar 50x/0.55 DIC 27 |
| ZEN imaging software | Zeiss | ZenPro 2012 | |
| CapImage | Dr. Zeintl | ||
| Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | 45946 | |
| bisBenzimide H 33342 trihydrochloride | Sigma-Aldrich | B2261 | harmful if swallowed; causes severe skin burns and eye damage, may cause repiratory irritat |
| Rhodamine 6G chloride | Invitrogen | R634 | harmful if swallowed; may cause genetic defects; may cause cancer; may damage fertility or the unborn child |
| Pentobarbital | Merial | Narcoren® |
References
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